Phanta超高保真酶

P501-d1/d2/d3PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymeraseVazymebiotechco.,ltd.PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase是一种基于PfuDNAPolymerase改造而成的新一代超保真DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性，可用于几乎所有PCR反应。经过对PfuDNAPolymerase的基因工程改造，PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase的行进性(processivity)得到了大幅度提升，即使是非常复杂的模板，也能准确快速的完成反应。错配率是普通Taq酶的1/52，是Pfu的1/6；且扩增速度可以达到15秒/kb。高保真性以及卓越的扩增效率使得PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase成为高保真PCR的首选用酶。PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase具有5’→3’聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，扩增产物为平端，适用于ClonExpressTM快速克隆试剂盒(C112/C113)。5×PhantaSF反应缓冲液对于简单或复杂模板、短片段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。已经含有10mMMg2+(1×终浓度为2mM)，可以使用随酶提供的DMSO或MgSO4对反应体系进行优化。附带的PCREnhancer可有助于高GC含量片段的扩增。用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，74℃30分钟内，摄入10nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义为1个活性单位(U)。核酸外切酶残留检测：10U的本酶和0.6μgλ-HindIII在74℃下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。核酸内切酶残留检测：10U的本酶和0.6μgSupercoiledpBR322DNA在74℃下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。大肠杆菌残留DNA残留检测：50μl体系中，加入2U本酶，以ddH2O为模板，扩增E.coli16srDNA基因。35个循环后进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，无扩增条带。功能检测1：50μlPCR体系中加入1U本酶，以100ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsingene。30个循环后将1/10PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的8.2kb条带。功能检测2：50μlPCR体系中加入1U本酶，以10ngλDNA为模板扩增30个循环，1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，可见有单一的15kb条带。-20℃保存。ddH2O5×SFBuffer(with10mMMgSO4)25mMMgSO4adNTPMix(10mMeach)bDMSOc5×PCREnhancerd模板DNAe引物1(10μM)引物2(10μM)PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μl)fto50μl10μloptional1μloptionaloptionaloptional2μl2μl1μl模板种类/扩增长度基因组DNA质粒或病毒DNAcDNA1kb50ng～250ng10pg～20ng1kb～10kb100ng～300ng10pg～20ng10kb150ng～400ng1ng～30ng1–5μl(不超过PCR反应总体积的1/10)a.对于大多数PCR反应，Mg2+最佳终浓度为1.5-2mM。体系中已含有终浓度为2mMMg2+，如有需要，可用25mMMgSO4，以0.2-0.5mM为间隔向上摸索Mg2+最佳使用浓度。b.请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。c.GC含量60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。d.推荐仅当扩增子GC含量60%且优化条件也无法正常扩增时使用；可能会降低保真度。e.不同模板最佳反应浓度有所不同，下表为50μl反应体系推荐模板使用量：f.推荐的酶的终浓度为1U/50μl反应。然而，根据扩增子的长度和复杂程度不同，可将PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase在0.5～2U/50μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50μl，尤其当扩增子长度大于5kb时。*PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase具有较强的校对活性。如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化。所有操作请在冰上进行，各组分解冻后请充分摇匀。为了防止PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶最后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃。5×SFBuffer请勿长时间敞口放置。1.P501-d1100UP501-d2500UP501-d31,000U5×SFBuffer(with10mMMgSO4)25mMMgSO4dNTPMix(10mMeach)PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μl)5×PCREnhancerDMSO10×Loadingbuffer1.25ml1ml100µl100µl500µl100µl1.25mlP501-d1×5P501-d1×10唯赞生物网址/咨询热线/400-600-9335销售/[e-mail]技术支持/[e-mail]技术服务/[e-mail].,LtdWeb/@vazyme.comSupport/[e-mail]/[e-mail]3.2循环步骤预变性a变性b退火c延伸d彻底延伸循环步骤预变性变性延伸彻底延伸循环步骤预变性变性退火延伸彻底延伸组分ddH2O5×SFBuffer(with10mMMgSO4)dNTPMix(10mMeach)引物1(10μM)引物2(10μM)模板DNADMSO5×PCREnhancerPhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase(1U/μl)20μl反应体系Upto20μl4μl0.4μl0.8μl0.8μl100ng0.600.60μl0440μl0.4μl温度98℃98℃45℃～72℃72℃72℃时间3min10sec10～30sec15～30sec/1kb5～10min循环数125～351温度92℃92℃68℃68℃时间2min5～10sec15～30sec/kb5～10min循环数1125～35温度95℃95℃45℃～72℃72℃72℃时间30sec～3min5～10sec10～30sec15～30sec/kb5～10min循环数125～351a.推荐大多数模板的预变性温度为95℃，时间为：质粒或病毒DNA，30sec，基因组2min，cDNA3min；对于高GC含量模板，预变性温度需提升至98℃，变性时间为2～4min；对于超过10kb的扩增子，预变性温度需降低至92℃，变性时间不超过2min。b.对于大多数模板在95℃变性时间设为5～10sec即可。对于高GC含量模板，变性温度需提升至98℃；对于超过10kb的扩增子，变性温度需降低至92℃，并延长变性时间至15sec。c.PhantaTMSuper-FidelityDNAPolymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。因此，推荐退火时间设置为10sec即可。对于一些困难模板，退火时间可在10～30sec之间调整。d.对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。对于超过10kb的扩增片段，需降低延伸温度至68℃。延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时，可使用15sec/kb的延伸时间；使用基因组,cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时，延伸时间应为30sec/kb。太长的延伸时间会导致非特异性扩增增加，因此延伸时间请勿超过30sec/kb。*使用高质量的模板；*使用长引物。将引物加长至Tm值68～72℃，把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性；*适当提高PhantaTM酶量，但50μl反应体系内不要超过2U；*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～6%；*推荐反应条件设置：*使用高质量的模板；*提高变性温度至98℃；*添加DMSO，以1%的浓度递增。调整范围为0%～8%；*添加5×PCREnhancer；*推荐反应条件设置：对于常规PCR反应，引物浓度、dNTP浓度、酶浓度、模板浓度、Mg2+浓度可不做特别调整，使用前述一般推荐用量即可。当使用新引物初次扩增目标片段时，可使用随酶提供的两种添加剂(DMSO、5×PCREnhancer)对反应体系进行初步优化。多数目标片段通过这一优化即可建立良好的扩增体系。下面以人基因组为模板扩增6kb片段为例(引物退火温度59.2℃)，推荐实验方案为：可见，当退火温度为56℃时，在反应体系中添加DMSO可显著提高扩增效果；当退火温度为60℃时，在反应体系中添加5×PCREnhancer可显著提高扩增效果。如引物二聚体不影响实验结果（回收后用于克隆），再次扩增时使用以上两条件之一即可；如需去除引物二聚体，可在此基础上做进一步优化。扩增产物电泳检测结果为：1.引物3’端最后一个碱基选择C或G；2.引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；3.引物3’端尽量避免出现发夹结构；4.引物Tm值控制在55℃-65℃之间；5.引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；6.引物GC含量控制在40%-60%之间；7.正向引物和反向引物Tm值以及GC含量尽可能一致。唯赞生物网址/咨询热线/400-600-9335销售/[e-mail]技术支持/[e-mail]技术服务/[e-mail].,LtdWeb/@vazyme.comSupport/[e-mail]/[e-mail]