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基因沉默的应用实例目录基因沉默的概述RNA干扰1234RNAi的生物学意义•定义：基因沉默（genesilencing）是指生物体中特定基因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象。基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着在线虫、真菌、水螅、果蝇以及哺乳动物中陆续发现。1.基因沉默转录水平上的基因沉默转录后基因沉默基因沉默发生的水平由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性降解而使基因失活基因沉默的方法•1.基因及其启动子甲基化•2.同源基因间的反式失活•3.后成修饰作用导致的基因沉默•4.重复序列•5.位置效应（一）转录水平基因沉默：（二）转录后水平基因沉默RNA干扰基因压制共抑制•RNA干扰（RNAi）：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。2.RNA干扰RNAi的特征（1）RNAi是转录后水平的基因沉默机制；（2）RNAi具有很高的特异性；（3）RNAi是以催化放大的方式进行的，因而RNAi抑制基因表达具有高效性；（4）RNAi可以穿过细胞界限抑制基因表达而且可以遗传；（5）dsRNA需要大于等于21个碱基（6）ATP依赖性RNAi的分子机制•相关酶及复合体-----•Dicer：RNaseIII特异核酸酶•一种与RNAi有关的RNaseIII家族的酶，是生物进化中非常保守的序列，可以将dsRNA切割形成21-23nt的siRNA。•RdRP：(RNA-dependentRNApolymerase)•以单链RNA为模板，按碱基配对原则合成其互补链，形成双链RNA。RNAi的原理RNAi的基本过程siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量；RISC（RNA-inducedsilencingcomplex）形成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量；RISC活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式；阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下，RISC识别并切割互补的靶RNA。RNAi研究的一般技术路线siRNA的设计•siRNA（smallinterferingRNAs，siRNAs）即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链RNA分子。一般设计原则：（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。（2）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列同源的序列。（3）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计4-5个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。负对照（1）一个完整的siRNA实验应该有负对照。（2）作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。（3）通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。制备siRNAs的方法化学合成体外转录siRNA表达载体siRNA表达框架用RNaseIII消化长片断双链RNA制备siRNA体外转录•以DNAOligo为模板，通过体外转录合成siRNAs，成本相对化学合成法而言比较低，而且能够比化学合成法更快的得到siRNAs。不足之处是实验的规模受到限制。•值得一提的是体外转录得到的siRNAs毒性小，稳定性好，效率高，只需要化学合成的siRNA量的1/10就可以达到化学合成siRNA所能达到的效果，从而使转染效率更高。•最适用于：筛选siRNAs，特别是需要制备多种siRNAs，化学合成的价格成为障碍时。•不适用于：实验需要大量的，一个特定的siRNA。长期研究转染细胞•将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：•1.磷酸钙共沉淀•2.电穿孔法•3.DEAE-葡聚糖和polybrene•4.机械法•5.阳离子脂质体试剂为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：•1.纯化siRNA•2.避免RNA酶污染•3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性•4.避免使用抗生素3.基因沉默的应用实例抗肿瘤策略抗病毒RNAi技术在功能基因组中的应用RNAi技术在法医学中的应用抗肿瘤策略RNA干扰CYP17基因抑制前列腺癌细胞生长CYP17基因•CYP17基因位于染色体10q24.编码细胞色素P-450cl7a酶,后者介导着17、20裂解酶和17a羟化酶的活性,他们是由胆固醇合成睾酮过程中的两个关键酶,在人体性激素的合成中起非常重要的作用,在前列腺肿瘤的发生、发展及转移中起重要作用。策略•利用RNAi降解CYP17mRNA,使CYP17基因所编码蛋白的合成明显降低,降低CYP17基因蛋白对其下游基因的调控,在很大程度上阻断了肿瘤细胞的应答,建立一种基因修饰前列腺癌治疗策略,提高前列腺癌的治疗效果。新鲜前列腺癌标本组织中总RNA的提取合成cDNA第一条链PCR模板DNAsiRNA体外转录siRNA的制备反转录慢性病毒载体法•慢病毒(lentivius)属于逆转录病毒，具有以下的优点：①可以感染非分裂期细胞。②容纳外源性基因片段大。③可以长期表达。④不产生任何有效的细胞免疫应答,可作为一种体外基因运输的工具。⑤慢病毒载体介导的转基因表达能持续时间长。•慢病毒载体(LV)介导的RNAi可使siRNA转录结构完整地整合到肿瘤细胞的DNA链上,稳定而持久地产生siRNA,从而发挥RNAi作用,下调目标基因的表达,是建立CYP17RNAi前列腺癌细胞模型的理想工具。研究结果•干扰组的细胞生长曲线较对照组细胞出现明显的压低,同时细胞活力明显降低,这一结果提示在CYP17基因被干扰后,前列腺癌细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力被抑制。对照组实验组研究结论•建立裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射CYP17重组慢病毒载体组的生长速度较对照组明显减慢。CYP17重组慢病毒载体组可抑制已形成的裸鼠前列腺癌移植瘤在裸鼠体内的生长和CYP17高表达。4.RNAi的生物学意义•随着后基因组学时代的到来，RNAi作为一种有效、经济的分析基因功能的技术，不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学)的发展,还有可能设计出RNAi芯片,高通量地筛选药物靶基因,逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且它还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域。