DGGE-TGGE

DGGE/TGGE技术及其应用•一、概述•二、原理•三、仪器•四、特点•五、条件实验•六、应用领域一、概述•DGGE：变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis）。•TGGE：温度梯度凝胶电泳（temperaturegradientgelelectrophoresis）。•DGGE最初是Lerman等人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术-TGGE。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。二、原理•DGGE/TGGE技术是根据DNA片段解链温度的差异将长度相同，但序列不同的DNA片段分离开来。•相同序列的DNA片段，具有恒定的解链温度(Tm)，但若其序列发生改变，Tm值亦发生改变，在含有变性因素(变性剂，高温)的凝胶中电泳时，当其双链解开形成分叉时，电泳迁移的速度就会大大降低，序列中出现单碱基替换时，Tm亦发生改变，电泳迁移率亦改变，此即DGGE/TGGE分离相同长度片段和鉴定突变的技术基础.•为了提高DGGE的突变检出率，发明者人为地加入一个高熔点区，就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构，即GC夹（GCclamp）这样，在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区，使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此，DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。•乳杆菌（Lac-1，Lac-GC-2）•5'-AGCAGTAGGGAATCTTCCA-3'（19bp）•5'-GCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGCCCGGGGGCACC•GGGGGATTYCACCGCTACACATG-3’（58bp）•分辨率高，可达到一个碱基。•具有精密控温系统，比一般聚丙烯酰胺凝胶电泳具有更高的可重复性。可使电泳在5-70℃之间的恒定温度下进行（低于室温电泳需外接冷却装置），整块胶内的温差在0.5℃以内，控温范围45~70℃，加热器和温控部分可使温度最慢以0.1℃/h、最快以200℃/h上升。•能非常快速的对大量的混合标本进行分析，如肠道微生物、土壤微生物群落结构等。进而克隆测序，比一般电泳仅仅根据片段长短进行分离前进了一大步。•几乎可以检出所有突变，无须对引物标记。解链温度取决于互补链的氢键含量和相邻碱基的引力，DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。•可将突变分子完好无损地同野生型分子分开用于进一步的分析。•可检测流感病毒基因多样性，遗传图谱分析，单核苷酸差异SNP检测。•可检测出象甲基化之类的DNA修饰。•检测片段长度可达1kb，尤其适用于100~500bp的片段。三、特点•1.如何确定变性梯度/温度梯度范围•根据变性剂梯度方向和电泳方向的不同，可分为：垂直DGGE，即变性剂梯度与电场方向垂直，常用于试验决定最佳变性剂梯度范围；平行DGGE，其变性剂的梯度和电场方向平行，主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。四、条件实验•2.如何确定电泳（分离）时间•平行胶间歇上样DGGE实验流程：DNA样品的提取→PCR扩增→DGGE电泳→带型分析→特征条带的测序五、仪器六、应用领域•主要应用于环境样品细菌、古细菌、真菌、真核微生物的多样性分析（土壤、水等样品无需培养，直接提取DNA扩增检测）；•动、植物体内外共生微生物的检测；•食品微生物的检测；•医学领域碱基突变的检测，杂合子检测等等。环境样品基因组DNA的提取目标片段的PCR扩增DGGE图谱的分析图像的采集和条带的回收DGGE分析电泳前准备工作电泳分析剥胶、染色DGGE条带测序七、DGGE分析微生物群落的主要步骤•由于各类微生物（如细菌和古细菌）的16srRNA基因序列（16srDNA）中可变区的碱基顺序有很大的差异。应用DGGE技术分析土壤中细菌和肠道中细菌的16srDNA的V3区片断，根据电泳条带的多寡和条带的位置可以初步辨别出样品中微生物的种类多少，粗略分析土壤和肠道中微生物的多样性。总DNA的提取是DGGE研究微生物群落的基础。适合的DNA提取方法对环境样品微生物群落结构分析非常重要。适合DNA提取方法的考量：①DNA的得率。②能否进行PCR扩增以及扩增的重复性。③制备DNA花费时间的长短。关于DNA提取的建议：优先考虑基于原位裂解的方法，根据实际情况采用酶解/酚氯仿抽提法，或者DNA提取试剂盒（建议购买Qiagen公司相关产品）。1.环境样品基因组DNA的提取2.目标片段的PCR扩增采用2次PCR扩增：第一次扩增用引物不带GC夹子，以粪便总DNA为模板，Touchdown反应程序。第二次扩增引物用带GC夹子，以第一次扩增的产物为模板，只扩5个循环。叫Reconditioning-PCR，3.关于DGGEmarker的制作带手套。配置试剂时一定要用去离子水，可以配置不同梯度的变性溶液备用，注意变性溶液中大颗粒的过滤及脱气。制胶洗膜时用的各个容器要用去离子水洗涤干净，以防止氯离子污染。灌胶前准备好所有需要的东西，试剂、枪头，甚至物品摆放的位置。制胶是实验的关键，在往玻璃板中灌胶时要匀速地转动滑轮，将凝胶液匀速地灌入玻璃板。灌胶后立刻清洗注射器，以防丙烯酰胺凝固，堵塞管子。4.DGGE前的准备工作•上样的胶孔要用去离子水冲洗干净并吸干。•PAGE胶装入电泳支架时注意用去离子水润滑橡胶垫。装入后在胶孔中加入缓冲液。•上样时上样器要深入胶孔底部。•尽量在同一个胶上比较所有样品，每一个胶上要有markerlane。•将胶放入电泳槽中时注意正负极。•建议低电压电泳一段时间，在样品完全进入胶中之后再升电压。5.电泳•停止电泳后注意把电泳仪调零之后在关闭电源•剥胶需要细致，用好去离子水和保鲜膜。•染色前做好胶样品顺序的标记。•银染、EB染色和SYBRGreen染色。6.剥胶与染色获得高质量的DGGE图谱。DGGE条带的回收－－注意紫外条件下操作的安全。－－尽量减少DNA在紫外下的照射时间。－－目标片段从切胶条带中的回收。测序注意要点－－回收条带的DNA在PCR扩增后，一定要克隆－－确认克隆与母条带可以跑到同一个位置后，再送去测序－－每个条带至少测3个克隆8.测序结果比对、聚类分析－－结果与GenBank和RDP数据库比对7.图像的采集和条带的回收、克隆、测序9.DGGE图谱的数字化——Quantityone1）DGGE图谱的聚类分析、主成分分析10.DGGE图谱的分析•用Sorenson配对相似性系数（pairwisesimilaritycoefficient，Cs）比较不同样品PCR-DGGE图谱的相似性•Cs=2j/(a+b)×100%•其中a、b分别表示两个比较对象的条带数，j表示a和b中共有的条带数。完全不同的两个图谱的Cs是0%，而完全相同的两个图谱的Cs是100%。2）DGGE图谱的相似性分析TableCsvaluesbetweensamplesCs(%)D1D2D3C1C2C3N1N2N3D1100D289100D38995100C1929393100C289898482100C389898482100100N1333226313333100N239373236394489100N33942263128339483100AmongKKAymiceCs=82%-100%,C57BL/6JmiceCs=83%-94%,andthedifferentgenotypesmiceCs=26%-44%条带的相对密度可以用来表示该样品中微生物种类的丰富度。利用QuantityOne®v4.4（Bio-Rad，Hercules，CA）软件将PCR-DGGE图谱变为波峰图，每个波峰代表一个条带，即一种菌，峰面积则代表该菌的数量。将PCR-DGGE图谱去背景，为了避免拥挤的条带在测定面积时产生误差或难以分辨，将各条带高斯（Gauss）建模处理。采用Shannon-Weaver指数（多样性指数，H’）描述菌群的多样性H’=-ΣpiInpi=-Σ(ni/N)In(ni/N)公式中ni为某一个体第i条带的峰面积，N为此个体所有条带的峰面积之和[63]。3）多样性指数的计算•八、TGGE的衍生技术•1.TTGE：时间温度梯度凝胶电泳•采用DGGE变性梯度凝胶电泳系统的原理但不使用化学变性剂梯度，操作更简单、快速并便于重复。DNA上样于含尿素的聚丙烯酰胺凝胶。电泳过程中逐步、均一地升高温度，从而在电泳运行过程中产生一个线性的温度梯度，变性环境由凝胶中均一的尿素浓度加上时间温度梯度形成。•TTGE技术指标：•温度控制器与加热器可使温度缓慢地以0.1℃/hr的速度上升•无需化学梯度，电泳时间为5-8小时，使设置和制胶更方便•对照试剂与已证明有效的规程使你可以立即开展实验•分辨率高，温度梯度由微处理器控制，线性极为严格•重现性好，电泳条件（如温度、时间等）易于控制，可以保证电泳的重现性和结果的重复性•2.SSCP：单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。•操作过程是：①PCR扩增靶DNA；②将特异的PCR扩增产物变性，而后快速复性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子；③将适量的单链DNA进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；④最后通过放射性自显影、银染或溴化乙锭显色分析结果。若发现单链DNA的迁移率与正常对照的相比发生改变，就可以判定该链构象发生改变，进而推断该DNA片段中有碱基突变。优缺点：简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。不足之处，只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。•3.CDGE：恒定变性凝胶电泳(Constantderatararedgelelectrophoresis)•是DGGE基础上发展起来的基因突变检测技术，亦是利用突变基因与正常基因片段间Tm值的差异来检测突变的方法，该方法与DGGE的区别在于聚丙烯酰胺中含的变性剂浓度相当于含突变基因片段的Tm值，而且浓度恒定，而不是线性递增.