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C&C多倍体与单倍体育种第三篇新品种培育技术C&C枣多倍体无籽葡萄西柚：葡萄柚（无核）美国多倍体大花萱草四倍体巨型草莓多倍体紫芦笋碧桃：桃的多倍体多倍体扇贝、牡蛎C&C本节主要内容：1.多倍体育种2.单倍体育种本节关键问题：多倍体形成的原理与方法C&C知识回顾染色质（Chromatin）是指细胞分裂间期遗传物质的存在形式。染色体（Chromosome）是指细胞有丝分裂或减数分裂过程中，由染色质聚成的棒状结构。染色质（Chromatin）和染色体（Chromosome）是同一物质在不同的细胞周期中不同的形态表现。人类染色体C&C几个基本概念1.染色体组（Chromosomeset/Genome）生物体配子的全部染色体称为一个染色体组。同一物种的染色体数目是相对稳定的。配子染色体为单倍体（Haploid），用n表示，称为一个染色体组。体细胞为二倍体（Diploid）以2n表示。多数生物体是二倍体：体细胞中染色体是两两成对的。例如，果蝇有4对共8条染色体(如图)，这4对染色体可以分成两组，每一组中包括3条常染色体和1条性染色体。C&C2.整倍体（euploid）体细胞内含有完整的染色体组的类型为整倍体。以小麦属为例。多个种的配子染色体数（n）都是以7个染色体为基数变化的。普通小麦n=21，2n=42是7的六倍3.非整倍体（aneuploid）体细胞内的染色体数目不是染色体组的完整倍数的称为非整倍体。多或少一个以至若干个染色体。C&C4.染色体变异染色体变异可体现在染色体数目和结构两个方面。染色体数目能以个体或以染色体组为单位的增加或减少。染色体组数量改变：成倍性增减。个体改变：一个细胞中的染色体数和正常二倍体的染色体数相比，出现了不规则的增多或减少，即为非整倍体畸变。C&C5.染色体工程按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的目的的技术。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。C&C第一部分多倍体C&C一定义多倍体（polyploid）：是指个体细胞中含有超过正常染色体组数的个体。是由Winkler于1916首先使用的。同源多倍体（autopolyploid）：多倍体的染色体来自于同一物种或在原有染色组的基础上加倍而成。异源多倍体（allopolyploid）：多倍体的染色体来自于不同一物种。自然界中存在的多倍体大多是异源多倍体。常见多倍体有三、四、五、六和八倍体。在被子植物中，至少有1/3的物种是多倍体。例如，普通小麦、棉花、烟草、苹果、梨、菊、水仙等都是多倍体。马铃薯是四倍体，普通小麦是六倍体。C&C二特点（1）形态上的巨大性（2）优良性状：光合效率提高、生长速度快、营养成分提高等。（3）抗病能力强：在对逆境的耐抗性方面会得到增强。例如：三倍体桑树：表现为体细胞较大、叶肉厚、叶色深、叶质较好、抗寒性增强。花卉：三倍体花器官增大、色彩更鲜艳，同时还能使花期延迟，大大提高了花卉的观赏价值和商业价值。三倍体鲍鱼：具有高度不育性，因而使体细胞生长方面的能量相对增加，增强了鲍鱼的抗逆性和抗病能力，提高了生长速度。此外，还可以延长鱼类寿命、控制过度繁殖。C&C问题1：为什么多倍体高度不育呢？联会(synapsis)同源染色体配对称为联会，是在减数分裂的偶线期两条同源染色体侧面紧密相帖并进行配对的现象。形成一个四分体。C&C以有3个染色体的三倍体为例，3n(n=3)在同源染色体联会时可能有四种取向的排列方式：四种中只有A形成的配子具有完整染色组的单倍体或者二倍体完整染色体的配子。占25%。其余3种组合所形成的配子都是非整倍体染色体的配子，这种配子由于剂量不同，一般不成活。C&C一般形成正常配子的几率是（1/2）n-1，这里n是一个染色体组中的染色体个数。如果是6对以上染色体，三倍体几乎全部不育。减数分裂时同源染色体联会时发生紊乱，很难将完整的一套染色体分配到一个配子中去。即：很难形成具有完整一套染色体组的配子。绝大多数配子中的染色体数目不正常。香蕉是三倍体，由于染色体的配对发生紊乱，从而不能正常地进行减数分裂，不能产生种子，只能通过无性繁殖繁衍后代。传统的无性繁殖往往通过地下球茎中的不定芽培育成苗。C&C问题2：三倍体高度不育有什么好处呢？食用方便：三倍体的西瓜因为很少产生有功能的生殖细胞，所以没有种子，无籽西瓜。食用方便，且含糖量高。利用的是三倍体高度不育性：生物安全：可以户外人工种植或养殖，与正常品种一起。其他优良性状：巨大、花期长等。三倍体的杜鹃花因为不育，所以开花时间特别长。抗逆、生长快、寿命长等。C&C植物多倍体现象普遍，多为异源多倍体。Grant(1971)估计，多倍体的频率：被子植物中占47％，其中双子叶植物占43％，单子叶植物占57％，禾本科植物大约有2/3是多倍体。在裸子植物中占38％，在松柏科植物中仅占1.5％，在蕨类植物中占95％。动物多倍体少，并多为同源多倍体。例如：甲壳类中的一种丰年鱼为四倍体；线形动物中的马蛔虫为同源四倍体(4n=4)；昆虫（孤雌生殖）：双翅目毛蠓科有三倍体的毛蠓；膜翅目的叶蜂科有四倍体的雌蜂。C&C问题3：为什么动物的多倍体比植物少？植物：（1）大多数植物是雌雄同体或雌雄同花的，它们的精原细胞和卵原细胞可能同时发生不正常的减数分裂，使配子中染色体数目不减半，这种配子通过自体受精而自然形成了多倍体。（2）植物的繁殖比较容易，如果多倍体植物不能形成种子，它还能依靠营养器官的无性繁殖来产生后代，因此在生物进化过程中，植物多倍体有可能被保存下来。动物：（1）高等动物的远源杂交能力很弱，这样难以形成杂种个体。（2）多倍体动物高度不育，染色体异常通常会造成胚胎死亡，因此很难得到多倍体的子代个体。C&C三多倍体产生原理与诱导方法C&C1.植物多倍体（1）产生原理主要是体细胞在有丝分裂的过程中，染色体完成了复制，但是细胞受到外界环境条件(如温度骤变)或生物内部因素的干扰，纺锤体的形成受到破坏，以致染色体不能被拉向两极，细胞也不能分裂成两个子细胞，于是就形成染色体数目加倍的细胞。C&C（2）诱导方法A化学方法细胞松弛素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞分裂。秋水仙素：分子式为C22H25O6•12H2O，是从一种百合科秋水仙属植物器官中提取的一种生物碱。能特异性地与细胞中的微管蛋白质分子结合，从而使正在分裂的细胞中的纺锤丝合成受阻，导致复制后的染色体无法向细胞两极移动，最终形成染色体加倍的核。细胞可以在药剂去除后恢复正常分裂。C&C秋水仙素处理方法处理部位：只有处理正在分裂的细胞才能获得多倍体。通常以植物茎端分生组织或发育期的幼胚为材料。处理方式：秋水仙素一般用水溶液，选择以下处理方法：浸渍法、涂抹法、棉花球滴渍法、喷雾法、注射法、药剂培养基法等。C&C药剂浓度：不同植物对秋水仙素的敏感性不同。实践证明，秋水仙素的有效浓度一般在0.01-0.4%，以0.2%左右的浓度最为常用。处理时间：一般不少于24小时。浓度高时处理时间可相应短些。处理温度：一般在18-25℃之间。C&CB生物方法生物学方法主要指体细胞杂交，利用染色体加倍个体与未加倍个体杂交繁殖多倍体后代，经常与化学与物理方法结合使用。异源多倍体一个代表性的例子是人工培育的小黑麦，它是由小麦（6（6n=42，AABBDD）和黑麦（2（2n=14，RR）杂交而成的。普通小麦的染色组是ABD，黑麦的染色体组是R，最后获得的杂种的染色体组是ABDR。异源多倍体（21+7）子一代不育，但只要将它的染色体加倍(42+14)，这样就能顺利地进行减数分裂而形成正常的雌雄配子，变为正常可育。培育出的八倍体小黑麦具有许多新的特点，形态上像小麦，但穗子、籽粒显著大于小麦，同时能抗寒冷、干旱、贫瘠等不良条件，在高寒地区和盐碱地区具有一般小麦不具有的优势，而且增产效果较明显，营养价值（如蛋白质）也有了较大改善。C&C2动物多倍体（1）产生原理：染色体的加倍可以通过保留受精卵第二极体即抑制卵子的第二次成熟分裂或抑制受精卵的第一次卵裂来实现。鱼类精子入卵的时期是第二次减数分裂的中期，刺激卵子继续完成第二次分裂。卵中原有的二组染色体中一组作为第二极体排出受精卵成为正常的二倍体。如果在精子入卵时第二极体不能正常排出，则精卵原核结合成为三倍体受精卵。如果卵子受精后，照常排出第二极体形成单倍体卵，单倍的卵原核与单倍的精原核结合就形成二倍的受精卵，这时再抑制受精卵的第一次卵裂，则产生四倍体。C&C（2）诱导方法A物理方法机制主要是通过破坏微管形成，使由微管蛋白聚合成的微管解体或阻止微管的聚合过程，使染色体失去移动的动力，人为抑制染色体向两极移动，形成多倍体细胞。C&C（1）温度休克法：即用略高于或略低于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体(抑制第二极体排放)或四倍体(抑制第一次卵裂)的方法。根据处理温度的高低分为热休克法和冷休克法。一般冷水性鱼类如蛙科鱼类，宜用热休克，温度范围为28℃--36℃;温水性鱼类宜用冷休克，温度范围为0℃左右。通过温度调控技术诱导多倍体是物理方法中简便而效果佳的方法之一。C&C（2）水静压法：采用较高的水静压（如65kg/cm2）可抑制卵母细胞第二极体的释放或者抑制第一次卵裂诱导产生多倍体的方法。静水压处理破坏了有丝分裂器中的纺锤丝即纺锤体和星体，从而暂时阻断了有丝分裂的进程。该方法易于掌握，处理程序易于标准化，诱导率较高。但需专门的设备如水压机等，同时样品室容量有限，不适宜大规模生产。此外，静水压处理还使染色体发生了不同程度的凝缩，导致染色体在后来的发育过程中呈现不同的变化。静水压处理不当还可能使受精卵的结构发生某些物理和化学变化，得到的子代不可避免地产生轻微的染色体畸变造成发育受阻。由于上述原因加上处理时对设备的要求生产中应用较少。C&CB化学法细胞松弛素诱导法：细胞松弛素B(CB)导致极体的保留是通过阻止卵子微丝环的收缩和极体的分离来实现的。CB处理比其他物理方法如温度、水压等能更有效地诱导三倍体的形成。6-甲氨基嘌呤诱导法：6–DMAP是一种蛋白激素酶抑制剂。当6–DMAP与微管蛋白二聚体结合以后对微管正常的结构和功能起到了抗有丝分裂的作用，因此可以产生三倍体。除了有效的抑制受精卵的染色体分离和原核的移动，6–DMAP会造成染色质分散从而使极体排放受阻诱导出三倍体。C生物法瑞齐（Rasch）等于1965首先证明了三倍体脊椎动物可通过四倍体个体与二倍体个体杂交产生。C&C四多倍体倍性的鉴定人工诱导不能百分之百地成功诱导出多倍体，处理过的群体可能是由多倍体、二倍体甚至是多倍体与二倍体构成的嵌合体等混合群体，所以需要鉴定染色体的倍性，从中筛选出需要的多倍体。常用的多倍体倍性鉴定鉴定方法有用间接法（如核体积测量、形态学检查等）和直接法（如染色体计数以及DNA含量测定等）两类。（1）核体积测量法：一般而言，细胞核大小与染色体数目成比例，为了维持恒定的核质比例，随着细胞核的增大，细胞大小也按比例增加。因此多倍体细胞及细胞核通常要比二倍体大一些。因此，通过体细胞核体积的测定可以鉴定染色体的倍性。缺点是比较费时、准确性不高。C&C（2）染色体计数法：将细胞固定制片、染色后观察染色体个数。由于染色体制片技术比较成熟，因此该方法仍是目前鉴定多倍体倍性的一种直观、准确的方法，缺点是比较费时。（3）DNA含量测定：细胞DNA含量测定是倍性鉴定的另一个比较有效的直接鉴定方法。可以测定单个细胞的DNA含量，再根据细胞DNA比较来推断出细胞的倍性。如果发现杂种的DNA含量是其亲本的一倍半，就可以确定这些杂种是三倍体。DNA含量测定法快速准确，能测出嵌合体，但是缺点是需要专门仪器。C&C五三倍体培育应用举例举例1：三倍体西瓜培育——同源多倍体代表性的例子无籽西瓜的果实由于没有籽、品质好、食用方便、高产抗病、耐贮运等优点而深受欢迎。C&C原理普通西瓜为二倍体植物，即体内有2组染色体（2n＝22）。三倍体（3n=33）减数分裂联会时期会发生紊乱，所以它本身是高度不育，一般没有种子。如用秋水仙素(