流式细胞仪质量控制及常见问题处理-薛向军

流式细胞术质量控制及常见问题处理MENU:SOP’sforallassaysReagentsSoftwareQCHumanInterface仪器方面步骤方面I系统性能参数对准性灵敏度线性度动力学范围II仪器设置分析窗口补偿III样品制备IV样品分析移液抗体溶解/固定门的纯度和回收率准确性和精确度可靠性核查全面质量控质系统性能参数灵敏度:仪器所能检测到的最低荧光线性度:在某一范围内结果与分析物浓度成正比的能力重复性:同一份标本间隔不同时段检测的结果之间的差异分辨率：流式细胞仪能分辨出同一种颗粒差别的能力系统性能参数----灵敏度手段(校对标准)——有多重荧光强度和MESF单位的微粒0256HistogramChannelFluorescenceUnitsDETECTIONLEVELBeadMESF/ABCChannelBlank00.2Bead#16774.6Bead#2264614.6Bead#3916550Bead#453728444.9Equation#1fromChart:y=Mx^BEquation#2fromChart:R-squared=CMvalueBvalueCvalue188.090.94720.9918Comments:LinearRegression:0.9918DetectionThreshold:41系统性能参数----荧光线性将不同荧光强度的微球混合，得到各个峰的平均荧光强度；根据标准微球说明书提供的各个峰的MEFL荧光分子数，以及分析得到的各个峰的平均荧光强度，做的线性回归。LogAmplifierLinearityVerification0123LevelLogMainXFL1FL2FL3FL4FL10.963787831.505149982.098643732.68295693FL20.707570181.27646181.898176482.53529412FL30.55630251.079181251.666517982.27461962FL40.591064611.103803721.696356392.30470591234R0.98系统性能参数----分辨率质控:分辨率,能量输出手段:校准标准物（FlowCheckorCaliBriteBeads),为高度均一并具有高荧光强度的单一群体应用:通过记录PMT电压和峰的%CV,作Levey-Jenning图来达到监测激光输出的目的功能:核实仪器的校准,检验光路、流路是否稳定GoodalignmentBadalignment光电倍增管PMTS的标准化应用:通道靶标;记录PMT电压;作Levey-Jenning图功能:达到分析范围的重复性,使细胞群的位置标准化颜色补偿颜色补偿的目的是将在每个PMT中各荧光染料发射的荧光信号的重叠部分除去.准确进行补偿以区分阴性和阳性细胞十分重要IncreaseinformationQualityresultsImprovedefficiencyFasterturnaroundConsistencyMorecolorstoimproveaccuracyandefficiency流式使用中最大的问题？电压调节？补偿调节？多色？应用？对照设置？其它……流式使用中最大的问题？Arecentsurveyof84%flowcytometristsindicatethatcompensationistheirbiggestchallengeBioCompareSurvey2008常见的补偿方法的误区及纠正直观看细胞群时看高度－中线对齐跑完对照后门的位置就固定－在补偿调节后重新确定门的位置来判断阴性和阳性人为通过荧光之间的补偿数据来判断补偿的好坏－无须凭数据，补偿与电压密切相关四色以上补偿仍然可以手工调节－四色以上补偿最好由软件进行自动调节可以用荧光微球来调节补偿－用细胞来调节补偿得到的结果最客观，最准确单激光四色自动补偿PANEL:确认电压单标记管自动计算CROSSOVER验证管WhichoftheplotsinpanelAandBthatcompensatedcorrectly?仪器方面步骤方面I系统性能参数对准性灵敏度线性度动力学范围II仪器设置分析窗口补偿III样品制备IV样品分析移液抗体溶解/固定门的纯度和回收率准确性和精确度可靠性核查全面质量控制标本及标本处理的质控•第一，标本的种类及外观•第二，单细胞悬液的获取•第三，抗凝剂的选择•第四，样本的保存•第五，去除红细胞的方法•第六，细胞与抗体的比例•第七，细胞活性的鉴定选择和确定单抗•第一，抗体组合应足够宽，能区分阴性和阳性细胞•第二，对弱表达的抗原尽量选用敏感的荧光素标记抗体•第三，了解不同抗体的染色谱•第四，抗体的组合尽量不相互干扰•第五，尽量选择IVD，CE级别抗体染色方法•第一，表面染色•第二，胞内染色•第三，胞内和表面标记同时检测质控时要选用稳定的全血制品-CD-ChexPLUS(StreckLaboratories)低,正常-Immuno-TrolCells，CYTO-TROL(Beckman-Coulter)低,正常-StatusFlow(R&DSystems)低,正常-Multi-CheckControl(BD)低,正常-Fluoro-Trol(Bioergonomics)－Transfixed(Tanzania)侧向散射光前向散射光淋巴细胞单核细胞嗜碱细胞粒细胞全血细胞裂解时的散射光嗜酸细胞嗜中性细胞Mid1980’s细胞直径891011121.0.8.6.4.20SSFS粒细胞单核细胞淋巴细胞淋巴/单核细胞大小分布的重叠淋巴细胞点图应用双向散射光时细胞形态学存在的固有问题大淋巴细胞小单核细胞Day4Day0A0A4CD45FITCCD45FITCB0B4SAMPLEAGECD45/SSGATEHETEROGENEOUSFS/SSGATEHOMOGENEOUSSAMPLEAGECD45设门大小和单核细胞沾染的关系1%2%3%CD45PerCPCD3FITCBergeron2002数据的获取和分析•第一，细胞获取数量•第二，阈值的设立通道和大小•第三，分析区域•第三，其它有用的参数，如平均荧光强度，荧光强度中位数，CV，细胞浓度等可靠性的核实TSUM:%CD3+4++%CD3+8+=%CD3±5%T细胞的平行测定2%LYMPHOSUM:CD3++CD19++NK=100%±5%荧光微球的流速（样本内质控）在质控方面移液的影响经常被忽略单平台绝对记数法要求精确和准确的测定,推荐使用反向加样法,要定期检查移液枪的精确度和准确性.精确准确精确和准确“Ringingphonesyndrome”SiteASiteB“Changeofoperatorsyndrome”SiteC“Stepperpipettesyndrome”Pass/FailcriteriaBasicElementsofDailyQCAlignmentCheckFluorescentStandardProcess/MethodControlPASSRunPatientPatientAnalysisObtainResultsGenerateReportTestReimbursementTroubleshootMaintenanceFAILCallServiceFixProblemHomeEndColorCompensation