流式常用试剂配制

一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。2、3％BSA/PBS：100mlPBS中加入3gBSA，使之溶解，再加入0.2ml10％的NaN3。3、500mmol/LEDTA：将186gEDTA•Na2•2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100mlPBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。6、红细胞裂解液：NH4Cl4.16g，KHCO30.5g，EDTA•2Na0.02g，溶于100ml水中，调PH至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/LPBS液（PH7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma的效果不错）。9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH7.4）。10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mgPI溶于10mlPBS，加入2mg无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5mlPI染液。11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl160gMgSO4•7H2O2gKCl8gMgCl•6H2O2gCaCl22.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4•12H2O3.04gKH2PO41.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1NNaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1NNaOH10ml。将溶解的酚红吸入100ml量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留的酚红液，并入量瓶中，最后补加双蒸水至100ml。将1）液和2）液混合，补加双蒸水至1000ml即为原液B。应用液：原液A1份原液B1份双蒸水18份混合后，分装于200ml小瓶中，高压灭菌。临用前用无菌的5.6％NaHCO3调PH至7.2～7.6。12、磷酸盐缓冲液的配制（PB）A液（0.2mol/LNaH2PO4水溶液）：NaH2PO4•H2O27.6g，溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。B液（0.2mol/LNa2HPO4水溶液）：Na2HPO4•7H2O53.6g加蒸馏水溶解，加水至1000ml。不同PH值PB的配制：A液xml（参照下表）中，加入B液yml，为0.2mol/L的PB。若再加蒸馏水至200ml，则成0.1mol/LPB。PHx/mly/ml5.793.56.55.892.08.05.990.010.06.087.712.36.185.015.06.281.518.56.377.522.56.473.526.56.568.531.56.662.537.56.756.543.56.851.049.06.945.055.07.039.061.07.133.067.07.228.072.07.323.077.07.419.081.07.516.084.07.613.087.07.710.090.07.88.5091.07.97.0093.08.05.3094.713、PBS的配制配制PBS，只要在相应的PB基液中加入8.5g/LNaCl即可。二、常用激活剂1、激活剂PMA：用DMSO配制成0.1mg/ml，分装20ul/管，－20度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠PBS1：100稀释储存液，终浓度为20ng/ml。2、激活剂离子霉素：用乙醇配制成浓度为0.5mg/ml的储存液，－20度保存。实验时用无菌、无叠氮钠PBS1：10稀释储存液，终浓度为1ug/ml。3、StaphylococcalenterotoxinB(SEB)：用无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL，4℃储存，SEB终浓度10ug/mL。4、CD3：包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。5、CD28：加速不同刺激剂（包括SEB、CD3等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml。6、阻断剂BregeldinA：用DMSO配制成浓度为5mg/ml的储存液，分装20ul/管，－20度保存。勿反复融冻。实验时用无菌、无叠氮钠PBS1：10稀释储存液，在激活过程最后4～5小时使用BFA，终浓度为10ug/ml。7、阻断剂莫能菌素：用DMSO配制成浓度为1mg/ml的储存液，4℃储存至少4个月，实验时用无菌、无叠氮钠PBS1：10稀释储存液，终浓度为2umol/L。三、常用抗体标记荧光染料的特性及其应用1、FITC：激发波长488nm，最大发射波长525nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。2、AlexaFluor488：激发波长488nm，最大发射波长519nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4～10）。3、Cy3：激发波长488nm，最大发射波长570nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。4、Cy5：激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。5、PE：激发波长488nm，最大发射波长575nm。1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。6、PE-TR：激发波长488nm，最大发射波长615nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。7、PE-AlexaFluor610：激发波长488nm，最大发射波长628nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。8、PE-AlexaFluor647：激发波长488nm，最大发射波长668nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）不易湮灭；3)可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。9、PE-Cy5：激发波长488nm，最大发射波长670nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4)可与FITC、PE搭配，荧光干扰小、补偿小，但不宜与APC搭配。5）与单核细胞和粒细胞非特异性结合多。10、PE-Cy5.5：激发波长488nm，最大发射波长694nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4)可与FITC、PE、APC搭配，荧光干扰小、补偿小，是APC比较理想的搭配。11、PE-AlexaFluor700：激发波长488nm，最大发射波长723nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）光淬灭性很强，要绝对避光。12、PE-Cy7：激发波长488nm，最大发射波长767nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2)可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）光淬灭性很强，要绝对避光；4）可与FITC、PE搭配，与FITC无光谱重叠，与APC搭配荧光干扰小，补偿小，是比较理想的搭配。13、TR：激发波长595nm，最大发射波长615nm。1）其标记的抗体适用于配备TexasRed激光器的流式细胞仪；2）荧光不易淬灭，可用于荧光显微镜。14、APC：激发波长633/635nm，最大发射波长660nm。1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）在BD细胞仪的FL4通道检测，在BeckmanCoulter细胞仪只有配备双激光器的FC500才能检测到。15、APC-Cy5.5：激发波长633/635nm，最大发射波长668nm。1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）主要用于四色以上的流式细胞术。16：PerCP：激发波长488nm，最大发射波长677nm。1）在BeckmanCoulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）可于FITC、PE搭配，荧光光谱重叠少，对随细胞的特异性结合少，但量子产量较低，适用于较高表达物的检测。