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土壤微生物研究规范——II.土壤样品的运输和贮存1.土壤微生物样品的运输土样从采集点到实验室往往需要经历一定时间的运输，土样运输过程中难免影响土壤的温度、水分、氧气等环境条件，所以要尽快置于黑暗、低温（4℃）的密闭环境，尽量维持土壤含水量稳定不变，黑暗环境是为了避免光照下藻类在土壤表明的生长，低温是为了减少细菌繁殖，维持微生物区系稳定。一般装于聚乙烯袋子，并松扎。另外，储存时尽可能避免物理压实，样品袋不要堆叠过多，以免破坏土壤原有的团粒结构，并导致底层样品处于厌氧环境。微生物取样的土壤样品需要在0-4℃的条件下保存，所以土壤样品应及时保存在保温箱或冰箱中（设置0-4℃），并最好在一周内完成前期处理。如果采集地有冰箱、熏蒸所需的真空干燥器和通风橱等设施，建议将微生物土壤样品熏蒸浸提后，以冷冻的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便运送。如果采集地没有通风橱等设施，建议将所取的土壤样品过筛后冷藏在保温箱中，以方便运送。具体的流程如下：（1）提前准备好保温箱及冷冻好的冰板。冰板需要提前1-2d冷冻，可以再用自封袋装一定量水分放平冷冻为规则的冰块备用。（2）按照微生物取样规范进行取样，及时过筛去除根系、土壤动物等杂质，放置在0-4℃保鲜冰箱中保存。用于DNA或RNA分析的土壤样品应用干冰速冻。用于RNA分析的土壤样品在运输过程中应用干冰保持低温。用于DNA分析的土壤样品应用冰盒运输，也可用干冰。（3）运输当天将土壤样品密封好，放入保温箱中，保温箱底部、四周及顶部均放置冰板和用自封袋密封的冰块，保证样品四周均可接触冰板或冰块。注意保证土壤样品和冰块分别密封，以防路途中融化的水分进入土壤样品造成污染。（4）到达目的地后，迅速将样品放入保鲜冰箱（0-4℃）保存待测。如果采样地条件允许，可以根据规范上的实验方法，将样品熏蒸、浸提后保存在塑料小方瓶中，-20℃冷冻，然后再按照上述流程放置保温箱中运送到目的地，迅速放置在冷冻冰箱中（-20℃）保存待测。如果购买不到保温箱，可以选用运输水果、蔬菜等的白色泡沫箱，密封严实后亦可。由于泡沫箱保温效果可能不及保温箱，路途较远时应多放置冰板及冰块，途中尽量不要打开，放入及取出都要及时，且需要提前确认样品采集地和目的地的冰箱是否留有足够空间存放土壤样品或者浸提液样品。特别要注意微生物样品的密封，放置融化的水分或者其他污染源污染样品。2.土壤微生物样品的处理采样后土壤样品应尽快处理手工过筛。过筛之前，去除样品中的植物、可见土壤动物和石粒等。推荐过2mm筛，促进颗粒间的气体交换，以利于保持土壤的好氧状态，也能去除小石头、动物和植物碎片。一些有机物质如粗腐殖质或泥炭不容易通过2mm筛，此时应在潮湿条件下过5mm筛。如果土壤太湿不能过筛，应该将其摊开，置于轻微流动的空气中，促其均匀风干。应不停地用手指捏碎并翻动土壤以免表面过度干燥，通常在室温下进行上述操作。如果土壤需要风干，不要过度风干，风干程度达到过筛要求即可。3、土壤微生物样品的储存土壤微生物样品管理和制备过程相对特殊，因此对土壤微生物样品在实验室内分析阶段的储存需要特别注意对储存条件和储存时间的控制，以保证检测结果准确。2.1微生物样品储存条件根据土壤微生物的观测指标、样品状态等的不同，对样品储存条件的要求如下：1）微生物生物量分析一般要求土壤鲜样置于4℃左右冷藏保存，可放在冰箱冷藏室或者事先放置冰板或冰块的保温箱中，不能处于冰点以下，以免冰冻影响微生物。一般的菌种保存也大多是在4℃，这个温度可以减小细胞繁殖，维持微生物区系的稳定性。2）土壤微生物样品经过熏蒸浸提等前处理后的浸提液样品置于-20℃左右的环境中冷冻保存。3）微生物多样性分析中Biolog板法、PLFA法或者DNA测序时大多都是采用冷冻法保存土样，且为了避免由于冷冻速度过慢导致菌体会表达大量的抗逆性基因和蛋白，样品可以速冻后（液氮罐），保存在超低温冰箱中（-70℃）。4）尽量减少开关冰箱或保温箱，以保证恒定低温效果。如遇停电等突发事件，做好相应应急处理措施。5）特别要注意微生物样品在实验室保存和分析过程中的密封，以免凝结的水汽或其他污染源对样品造成污染。6）每份样品保存量不能过多，不同样品之间避免堆叠，以免下部样品由于挤压形成厌氧环境。2.2微生物样品的储存时间1）待测样品的短期保存对于不同微生物种类的最适宜保存温度并不相同，低温也可以造成某些微生物的死亡，到目前为止尚不能确定低温确实可以保持原有微生物区系不变，因此土壤微生物样品要求在最短的时间内分析。一般认为土壤鲜样4℃下可保存一周，土壤浸提液-20℃下可保存一个月。ISO10381认为一般土壤微生物样品在进行分析前最长可以保存3个月，如果用于DNA分析应保存在-20℃条件下，用于RNA分析则保存在-80℃条件下。2）土壤微生物样品的长期保存（大于3个月）根据保存年限和针对的指标的不同，样品应保存在-20℃、-80℃或-180℃条件下（表IV-1）。已证实温带土壤样品在-20℃保存12月不会抑制微生物活性（如氨氧化活性）。而且用于磷酸脂肪酸（PLFA）和DNA分析的样品可以在-20℃保存1到2年。用于RNA分析土壤样品也可在-80℃保存1到2年。用于DNA、RNA和PLFA分析用的土壤样品推荐使用液氮速冻法。表IV-1好气条件下土壤样品的储存条件和年限指标引用标准鲜样（4℃）鲜样（-20℃）a鲜样（-80℃）或液氮（-180℃）a月年年PLFA，PLEL——b210DNA——210RNA————10生物量基质诱导呼吸法氯仿熏蒸浸提法ISO14240-1ISO14240-23110硝化势ISO156853110氮矿化ISO142383110土壤呼吸ISO160723110呼吸曲线ISO171553110脱氢酶活性ISO23753-1ISO23753-231——a土壤样品在长期保存以前应分成数份样品保存，以便后续取样分析；PLFA分析应该在采样后立即浸提新鲜土壤样品（2mm），浸提液可以在-20℃下保存数月后用于进一步分离和GC/MS分析；建议样品先在液氮中速冻，然后在-20℃或-80℃下保存。b——表示在该条件下无法长期保存。4、其他土壤样品的处理和贮存4.1新鲜样品的处理和贮存某些土壤成分如亚铁、易还原态锰、还原性硫、铵态氮、硝态氮等，在风干过程中会发生显著变化，必须用新鲜样品进行分析。为了能真实地反映土壤在田间自然状态下的某些理化性状，新鲜样品要及时送回室内进行处理和分析。先用粗玻璃棒或将样品弄碎混匀后迅速称样测定。新鲜样品一般不宜贮存，如需要暂时贮存，可将新鲜样品装入塑料袋，扎紧袋口，放在冰箱冷藏室或进行速冻固定。4.2风干样品的处理和贮存从野外采回的土壤样品要及时放在样品盘上，摊成薄薄的一层，置于干净整洁的室内通风处自然风干，严禁曝晒，并注意防止酸、碱等气体及灰尘的污染。风干样品过程中要经常翻动土样并将大土块捏碎以加速干燥，同时剔除土壤以外的侵入体。风干后的土样按照不同的分析要求研磨过筛，充分混匀后，放入样品瓶中备用。瓶内外各具标签一张，写明编号、采样地点、土壤名称、采样深度、样品粒径、采样日期、采样人及制样时间、制样人等项目。制备好的样品要妥为贮存，避免日晒、高温、潮湿，并避免酸碱气体的污染。全部分析工作结束，分析数据核实无误后，试样一般还要保存三个月至半年，以备查询。需要长期保存的样品，须保存于广口瓶中，用蜡封好瓶口。4.2.1一般化学分析试样的处理与贮存将风干后的样品平铺在制样板上，用木棍或塑料棍碾压，并将植物残体、石块等侵入体和新生体剔除干净，细小已断的植物须根，可用静电吸附清除。压碎的土样要全部通过2mm筛，未过筛的土粒必须重新碾压过筛，直至全部样品通过2mm筛为止。过2mm筛的土样可供pH、盐分、交换性能以及有效养分等项目的测定。将通过2mm筛的土样用四分法取出一部分继续碾磨，使之全部通过0.25mm筛，供有机质、腐殖质组成、全氮、碳酸钙等项目的测定。将通过0.25mm筛的土样用四分法取出一部分继续用玛瑙研钵磨细，使之全部通过0.149mm筛，供矿质全量分析等项目的测定。4.2.2微量元素分析试样的处理与贮存用于微量元素分析土样的处理方法同一般化学分析样品，但在采样、风干、研磨、过筛、运输、贮存等诸环节都要特别注意，不要接触可能导致污染的金属器具。例如采样、制样时使用木、竹或塑料工具，过筛使用尼龙网筛等。通过2mm尼龙筛的样品可用于测定土壤中有效态微量元素；从通过2mm筛的试样中四分法分取一部分样品，用玛瑙研钵进一步磨细，使之全部通过0.149mm尼龙筛，用于测定土壤全量微量元素。处理好的样品应放在塑料瓶中保存备用。4.2.3颗粒分析试样的处理与贮存将风干土样反复碾碎，使之全部通过2mm筛。留在筛上的碎石称量后保存，同时将过筛的土样称量，以计算石砾质量百分数，然后将土样混匀后盛于广口瓶内，作为颗粒分析及其他物理性质测定之用。若在土壤中有铁锰结核、石灰结核、铁或半风化体，不能用木棍碾碎，应细心拣出称量保存。参考文献ISO10381-6:2009Soilquality-Sampling-Part6:Guidanceonthecollection,handlingandstorageofsoilunderaerobicconditionsfortheassessmentofmicrobiologicalprocesses,biomassanddiversityinthelaboratory林先贵.2010.土壤微生物研究原理与方法.北京:高等教育出版社.29-31.GB/TXXXXX-2011/ISO10381-6:2009实验室测定微生物过程、生物量与多样性用土壤的好氧采集、处理及贮存指南（报批稿）NY/T1121.1-2006土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存