考马斯亮蓝法

实验7考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。在0.01—1.0mg蛋白质/ml范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英怀测定。三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸，加水稀释至1升。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。2、标准蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制，浓度控制在10—30mg/ml（二）器具1、试管及试管架2、移液管（1ml,5ml）3、可见光分光光度计四、操作步骤（一）标准曲线的制作1、取7支试管，按下表加入试剂试管编号试剂(ml)01234561mg/ml牛血清蛋白00.10.20.40.60.81蒸馏水10.90.80.60.40.20考马斯亮蓝试剂55555552、将试管摇匀，放置20分钟。3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。（二）样品的测定1、取一支试管，加入未知浓度的蛋白质溶液0.2ml，蒸馏水0.8ml考马斯亮蓝试剂5ml.2、将试管摇匀，放置20分钟。3、比色测定吸光值A595nm，对照标准曲线求得蛋白质的浓度。五、注意事项1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠，试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低，因而当蛋白质浓度较大时，标准曲线稍有弯曲，但直线弯曲程度很轻，不致影响测定2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始，力争1hr内完成，否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果。六、实验报告绘制标准曲线，并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析。七、思考题1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么？2、考马斯亮蓝法有什么优缺点？一、原理双缩脲法（Biuret法）和Folin―酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。因此考马斯亮蓝法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮蓝G-250（CoomassieG-250）是一种蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。但考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成的复合物是蓝色溶液，使该染料的最大吸收λmax的位置从465变成了595，在595nm处有最大吸收值。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，因此利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。优点：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。注：测定时要在染色后5-20分钟内测定光吸收，不可太快，我之前就不小心吃了这个亏，弄得数据很不稳定。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。缺点：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作曲线时通常选用g―球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。二、操作方法1.试剂（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml95%的乙醇后，再加入120ml85%的磷酸，用水稀释至1升。（颜色是褐红色，不能用R-250，R-250的颜色是蓝色的，要小心别弄错哦）2.标准曲线测定法注：样品的添加量问题要注意一下，我之前看有的资料说加1ml,有的资料加0.1ml,我都给弄混了，现在终于弄明白，其实：样品的添加量取决于你要测的蛋白的浓度，要浓度稀时，加1ml的量(即加样品后，用水补充到1ml)；浓度较大或适中时，加0.1ml3.操作过程：（加至1ml的）分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。蛋白质标准曲线测定加样试剂空白12345100ug/ml牛血清清蛋白/ml1.00.10.20.40.60.8牛血清清蛋白/ug01020406080去离子水/ml00.90.80.60.40.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.05.05.05.05.05.0吸光值A595加至0.1ml的，基本过程同上，数据是上面的1/10：各试管的试剂添加量如下，试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂（mL）5mL4.测量蛋白样品配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。3.试剂配置a.牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100ug/ml的蛋白溶液。b.考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml质量浓度为0.85g/ml的磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到1000ml。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。