2-folin-酚试剂法测定蛋白质含量

Lowry’s法（Folin-酚试剂法）测定蛋白质含量DeterminationofproteincontentbyLowry’smethod南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心生物化学与分子生物学实验教学中心实验目的掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。生物化学与分子生物学实验教学中心总蛋白测定经典和常见的方法比较方法灵敏度优点缺点适用范围凯氏定氮法0.2～1.0mg氮准确性好、精密度高、灵敏度高。操作复杂，费时用于标准蛋白质的定值、对其他方法校正等双缩脲法1～20mg特异性高、准确度性好、精密度高、操作简单方便，显色稳定。灵敏度低为临床测定血清总蛋白首选方法。Lowry法（Folin-酚法）20～250ug灵敏度高、达双缩脲法的100倍。干扰物质多、操作要求严格计时适用于测定单一蛋白质及测定蛋白质含量较少的标本如脑脊液紫外分光光度法50～100mg快速简便、无损样品灵敏度低、干扰物较多常用于较纯的酶和免疫球蛋白测定考马斯亮蓝法（Bradford）1～5ug灵敏、简便、快速，干扰因素较少不同蛋白质与染料结合力不一致，对比色杯有吸附作用常用于需求更高呈色灵敏度的蛋白电泳化学比浊法简便、不需特殊仪器影响浊度大小因素多，如加试剂手法、反应温度等一般用于测定尿液、脑脊液等蛋白质含量较低的样品生物化学与分子生物学实验教学中心选择测定方法时应考虑实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所花费的时间等。生物化学与分子生物学实验教学中心本法概述1921年，Folin首创，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应。1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。生物化学与分子生物学实验教学中心什么是双缩脲反应？两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。生物化学与分子生物学实验教学中心原理1第一步：双缩脲反应蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物（蛋白质-Cu2+复合物）。且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。生物化学与分子生物学实验教学中心原理2第二步Folin-酚显色反应Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸(Tyr)，故有此显色反应。即蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。生物化学与分子生物学实验教学中心原理3在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量。即根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。生物化学与分子生物学实验教学中心实验材料样品健康人血清（正常人血清蛋白质含量：60～80g/L）试剂1.牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）2.碱性硫酸铜溶液（当日有效）3.Folin-酚试剂仪器与器材1.V-1100分光光度计2.恒温水浴箱3.试管6支、试管架4.加样枪、加样枪架生物化学与分子生物学实验教学中心操作步骤取6支试管，做好标记，按下表顺序操作：加入物（ml）123456牛血清白蛋白标准液-0.200.400.600.80-样品液（300倍稀释）-----0.50蒸馏水1.00.800.600.400.200.50碱性硫酸铜溶液2.02.02.02.02.02.0各管蛋白浓度（ug/ml）04080120160未知各管混匀，室温放置10min。向各管内加入Folin-酚试剂0.20ml,2s内迅速混匀！40℃放置10min。冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。生物化学与分子生物学实验教学中心注意事项1Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后，必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。生物化学与分子生物学实验教学中心注意事项2因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0mL碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20mLFolin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20mLFolin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。水浴10min，冷却后，每一分钟测一管。生物化学与分子生物学实验教学中心实验数据记录表测定次数各管A值123456123用各管平均A值绘制标准曲线图生物化学与分子生物学实验教学中心绘制标准曲线步骤1、选择合适的坐标纸2、画坐标轴3、根据测得的数据描点4、连线5、求实验结果生物化学与分子生物学实验教学中心绘制标准曲线-1以A500值为纵坐标，牛血清白蛋白标准液浓度为横坐标，用铅笔绘制标准曲线。吸光度A蛋白质浓度C（μg/ml）0.20.40.6....4080120160（要写图题）生物化学与分子生物学实验教学中心绘制标准曲线-2根据所描点的分布情况，作直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。生物化学与分子生物学实验教学中心结果计算根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(μg/ml)。血清蛋白浓度(μg/ml)=样品蛋白质浓度×2×300最后浓度单位换算成g/L生物化学与分子生物学实验教学中心本方法的特点：优点：1.灵敏度高，比双缩脲法灵敏约100倍。2.操作简单，不需特殊仪器设备。缺点：1.费时间较长，要精确控制操作时间2.标准曲线也不是严格的直线形式3.专一性较差，干扰物质较多。生物化学与分子生物学实验教学中心复习思考题1、试述Folin-酚试剂法的优点？2、应用本方法有哪些干扰作用？为什么？应如何注意？请将答案附在实验报告上！生物化学与分子生物学实验教学中心值日生工作实验完毕，组长登记实验室使用记录。关闭仪器电源。清洁、归整实验台面，扫地、倒垃圾。回收试剂：将血清、Folin-酚试剂、牛血清白蛋白标准液试剂收回放至准备室冰箱。碱性硫酸酮试剂（每天最后实验的专业负责倾倒并清洗干净，将试剂瓶放至准备室）。生物化学与分子生物学实验教学中心V-1100分光光度计操作步骤开机，预热30分钟转动波长旋钮，调所需波长。按键切换到T档将黑体放入光路中，合上盖，按键校零开盖，将参比液按空白液、标准液、待测液顺序放入比色杯架上，合上盖，按键切换到A档拉动比色架拉杆，将空白液放入光路中，合上盖，按键校零拉动拉杆，将标准、待测液依次放入光路中，即可读取其吸光度A读数后，将黑体推回光路中，开盖取出比色杯将参比液倒回原试管中，清洗比色杯并晾干关机，盖上防尘盖，登记仪器使用登记本。MODE0%MODE100%