课题3---血红蛋白的提取与分离

课题3血红蛋白的提取与分离核心知识要点1．蛋白质的分离方法(1)凝胶色谱法：①概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。②原理：a．凝胶形态：微小的多孔球体组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道b．分离的方法：蛋白质的类型进入凝胶内部的程度路程移动速度相对分子质量较小的蛋白质容易较长较慢相对分子质量较大的蛋白质无法进入较短较快(2)电泳法：①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。②原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。③作用过程：各种分子带电性质差异分子本身大小不同分子本身形状不同不同的迁移速度各种分子的分离④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。2．血红蛋白的提取(1)红细胞的洗涤①目的：去除杂蛋白。②方法：采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水稀释，再离心，重复洗涤三次，直至上清液中不再呈现黄色，表明红细胞已洗涤干净。(2)血红蛋白的释放加蒸馏水(作用是使红细胞吸水涨破)到原血液的体积，再加40%体积的甲苯(作用是溶解细胞膜)，充分搅拌，细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液①将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min后，可以明显看到试管中的溶液分为4层。②将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体，即血红蛋白溶液。3．血红蛋白的粗分离——透析(1)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。(2)过程：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12h。(3)目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。4．血红蛋白的纯化——凝胶色谱法(1)原理：相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，路程较长，移动速度较慢而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。(2)过程①调整缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，调整缓冲液与凝胶面平齐②滴加透析样品：关闭下端出口，用吸管小心将1mL样品加到色谱柱顶端③样品渗入凝胶床：加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内④再调整缓冲液面：关闭下端出口，小心加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液到适当高度⑤洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱⑥收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集5．纯度鉴定——电泳判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。〖易错提醒〗(1)红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少，否则无法除去血浆蛋白；要低速、短时离心，否则会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。(2)红细胞中依次加入蒸馏水和甲苯的作用：加入蒸馏水的目的是使红细胞吸水涨破；甲苯溶解细胞膜，从而使血红蛋白释放出来。(3)分离血红蛋白时，可明显看到试管中的溶液分为4层：第一层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第3层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。(4)凝胶的预处理：用沸水浴法不但节约时间，而且除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。(5)色谱柱的装填：装填时尽量紧密，减小颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。(6)加样顺序是：调整缓冲液面、滴加透析样品、样品渗入凝胶床、再调整缓冲液面。(7)色谱柱成功的标志：红色区带均匀一致地移动。1.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和部分CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离过程回答以下问题：(1)将上述实验流程补充完整：A___________________________，B为________________________。(2)洗涤红细胞的目的是去除_________________；红细胞洗涤干净的标志是________________________。释放血红蛋白的过程中起作用的试剂是________________________________。(3)红细胞洗涤时洗涤次数不能过少，否则________________；离心速度过高和________________会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。(4)为了加速膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用________________法进行加热，这种方法不但节约时间，而且能除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的____________。(5)在B过程中加入物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是________________________________________________________________________。在蛋白质分离过程中，如果红色区带______________________________________________________，说明色谱柱制作成功。2.请完成有关血红蛋白提取与分离的相关问题：(1)实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行破碎离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是_______________________。(2)在对样品进行处理时，主要包括________________、血红蛋白的释放；对样品进行粗分离时主要包括：分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析技术的原理是________________________________________________________________________。(3)同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术，将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速度的因素包括蛋白质分子的____________、________________以及分子的形状等。而加入SDS后，使得蛋白质的迁移率只取决于_____________________。(4)同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白的分离(如下图1)，他在操作中加样的正确顺序是________，在执行图1中②所示操作时，色谱柱下端连接的尼龙管应该________(填“打开”或“关闭”)。(5)图2是同学乙利用样品分离得到的结果，则图2中蛋白质相对分子质量最小的是________。3.如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列问题：(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用体现了蛋白质具有___________功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是____________；乙装置中，C溶液的作用是_______________。(3)甲装置用于____________，目的是____________________________。用乙装置分离蛋白质的方法叫_____________________，是根据____________________分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_______________________________时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。4.如今人类已跨入了蛋白质时代，对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________、_______、__________和纯度鉴定。(2)血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、_________、分离血红蛋白溶液和__________。其中分离血红蛋白溶液时需要用到__________(仪器)分离出下层红色透明液体。(3)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。这是因为______________________________________________。(4)欲探究色谱柱的高度是否影响蛋白质分离的因素，应把_________________作为自变量，把_________________________________作为无关变量，把________________作为因变量。