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植物细胞工程常用的技术手段有哪些？那么动物细胞常用的技术手段呢？植物组织培养植物体细胞杂交问题探讨动物细胞培养动物细胞融合生产单克隆抗体动物细胞核移植动物细胞工程常用技术其中动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础学习目标：1、简述动物细胞培养的过程、条件及应用2、对比说出动物细胞培养与植物组织培养原理、条件、结果、培养目的一.动物细胞培养从动物机体中取出相关组织，将它们分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。(一)概念一、动物细胞培养过程阅读“动物细胞培养过程”并思考：1、动物细胞培养的技术实施的原理是什么？特点是什么？2、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？5、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？6、简述动物细胞培养的操作过程。1、动物细胞培养的技术实施的原理是什么？原理是细胞增殖（有丝分裂）。一、动物细胞培养过程动物细胞生长特点：细胞贴壁：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。要求：培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。细胞的接触抑制：当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。50代以后失去接触抑制接触抑制动物细胞生长特性部分细胞突变，获得不死性，向癌细胞方向发展，糖蛋白减少。2、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？分散的单个细胞容易摄取所需的营养，排出代谢废物；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难。一、动物细胞培养过程3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？细胞间的物质主要是蛋白质（胶原纤维）。胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.2～8.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.2～7.4。一、动物细胞培养过程4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。一、动物细胞培养过程5、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们的细胞分化程度低，增殖能力强，分裂旺盛，容易培养。一、动物细胞培养过程6、简述动物细胞培养的操作过程分离组织（低幼动物）分散细胞（胰蛋白酶）原代培养（细胞增殖）传代培养（细胞增殖）分装聚焦一、动物细胞培养过程深度思考：7、什么是原代培养、传代培养？为什么要进行传代培养？8、传代培养中，第10代细胞与第50代以后细胞的主要区别是什么？9、你如何解释“多利”的早衰现象？一、动物细胞培养过程10、动物细胞培养能否象植物组织培养那样获得克隆个体？需要诱导其脱分化的过程吗？7、什么是原代培养、传代培养？为什么要进行传代培养？原代培养：取材（动物组织）→细胞分散→初次培养传代培养：培养的细胞→细胞分散→继续培养进行传代培养的原因：接触抑制一、动物细胞培养过程8、传代培养中，第10代细胞与第50代以后细胞的主要区别是什么？细胞癌变,失去接触抑制特性。一、动物细胞培养过程9、你如何解释“多利”的早衰现象？培育“多利”所取细胞核来自成年羊。从细胞年龄来看，“多利”出生时，已是“羊”到中年。一、动物细胞培养过程10、动物细胞培养能否象植物组织培养那样获得克隆个体？需要诱导其脱分化的过程吗？不可以，因为高度分化的动物细胞的全能性受到抑制。不需要诱导其脱分化。一、动物细胞培养过程小结过程：幼龄动物或胚胎的组织、器官细胞悬浮液（单个细胞）胰蛋白酶动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。（分解弹性纤维）10代细胞原代培养50代细胞传代培养细胞株无限传代细胞系接触抑制剪碎一、动物细胞培养过程动物细胞培养不能最终培养成生物体原代培养(primaryculture)•定义：把第1代细胞的培养与传10代以内的细胞培养统称为原代培养。•过程：从动物机体中取出组织剪碎加胰蛋白酶细胞游离加培养液将细胞接种到培养瓶内培养（1—2天换一次培养液）细胞贴壁生长长成单层细胞取材（动物组织）→细胞分散→初次培养传代培养(subculture)•定义：当原代培养的细胞生长停止，这时如果要使细胞继续生长，就要及时用胰蛋白酶等，使细胞从瓶壁上解离下来，然后加入新的培养液，将细胞分离稀释，并从原培养瓶内转接到新的培养瓶内，这个过程称传代培养培养的细胞→细胞分散→继续培养细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。细胞株和细胞系的区别：细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中据此思考：1.内环境稳态包括呢些方面？适宜的温度、pH值、渗透压、营养、氧气。2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？无菌、无毒的环境。二、动物细胞培养条件3.体外培养细胞时需要提供哪些物质？如何才能保证类似于内环境的营养环境？培养基应是液态还是固态？充足的营养、适宜的温度、pH和气体环境。加入动物血清。培养基应是液态。思考：动物血清的作用？主要是：提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质等。保证细胞顺利的生长增殖多细胞动物和人体的细胞都生活在内环境中，根据你所学的内环境的知识，思考以下问题：1.体外培养细胞时需要提供哪些物质？2.体外培养的细胞需要什么样的环境条件？P46讨论充足营养（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等合成成分及血清、血浆等天然成分。）适宜温度、PH和气体环境；无菌无毒环境动物细胞培养条件总结：1、无菌、无毒的环境（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）2、营养（葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等。）3、温度和PH36.5+（-）0.5度,7.2-7.44、气体环境：O2和CO2（95%空气和5%CO2）保证细胞顺利的生长增殖动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。与植物培养基相比其特点是：（1）液体培养基（2）含有动物血清动物体细胞大都生活在液体的环境植物组织培养呢？无机盐、蔗糖、维生素、生长调节物质、植物激素成分比较：三、动物细胞培养的应用P47最上面1、获得细胞产物，如蛋白质生物制品－病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等2、获得烧伤病人植皮所需的细胞3、获得细胞用于检测有毒物质4、为治疗及预防疾病提供理论依据。植物组织培养和动物细胞培养的比较比较项目植物组织培养动物细胞培养原理细胞的全能性细胞增殖培养基状态固体培养基液体培养基培养基特有成分蔗糖植物激素葡萄糖动物血清培养结果植物体细胞株、细胞系培养目的快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白1、叙述多莉羊、高产奶牛的克隆过程2、说出多莉羊和高产奶牛的克隆过程的不同点？3、说出体细胞核移植技术的应用前景及存在的问题学习目标：动物细胞培养能获得克隆个体吗？如何才能获得克隆动物？黑面绵羊去核卵母细胞白面绵羊乳腺细胞核细胞核移植重组细胞电脉冲刺激早期胚胎胚胎移植另一头绵羊的子宫妊娠、出生克隆羊多利四、动物体细胞核移植技术和克隆动物归纳动物核移植定义：将动物的一个细胞的细胞核移入一个已经去核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育成动物个体（克隆动物）动物细胞全能性受限。分类胚胎细胞核移植：体细胞核移植：细胞分化程度低，恢复全能性容易细胞分化程度高，恢复全能性不容易四、动物体细胞核移植技术和克隆动物卵细胞Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植早期胚胎卵裂C母绵羊子宫胚胎移植多莉羊分娩妊娠多莉羊的培育过程融合后的卵细胞阅读p47思考：1、哺乳动物核移植可以为哪几类？全能性如何？2、动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？四、动物体细胞核移植技术和克隆动物“多莉”是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物。这一巨大进展证明了分化了的动物细胞核具有全能性．四、动物体细胞核移植技术和克隆动物1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。能否依据“多利”的培育过程，进行优质奶牛的快速繁育？请说明理由。体细胞的细胞核具有全能性。读图2-21，思考：1、对比多莉羊和高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？2、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？3、为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？4、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？5、多莉羊和高产奶牛的克隆过程,哪一种更科学且易操作？6、简述高产奶牛的克隆过程。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、对比多莉羊和课本高产奶牛的克隆过程，找出操作过程的不同点？多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核次级卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物2、在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？为使核移植动物的遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物3、为什么用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞？10代以内的细胞一般保持正常二倍体的核型，未发生突变。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物4、体细胞核移植方法生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞四、动物体细胞核移植技术和克隆动物5、多莉羊和高产奶牛的克隆过程,哪一种更科学且易操作？卵母细胞当中的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞高，用它作受体更容易成功。将供体细胞注入受体细胞，使克隆动物更像供体动物。高产奶牛的克隆过程操作简便。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物6、简述高产奶牛的克隆过程。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物6、简述高产奶牛的克隆过程。四、动物体细胞核移植技术和克隆动物（MⅡ卵母细胞）去核的卵母细胞胚胎移植供体细胞注入去核卵母细胞激活受体细胞，完成分裂、发育去核卵母细胞体积比较大MⅡ卵母细胞去核培养的体细胞重组细胞重组胚胎新个体四、动物体细胞核移植技术和克隆动物电刺激促融合、分裂、发育1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为3～4t。（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？四、动物体细胞核移植技术和克隆动物首先从卢辛达耳朵（也可用别的组织、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的