基因治疗的发展与应用

华东理工大学2013-2014学年第1学期研究生《环境分子生物学》课程论文2013年10月开课学院(School)：资环学院，课程编号（coursecode）008M083001C023成绩(Remark)：学生姓名(Name)：__王璐__学号(StudentID)：030131215任课教师(Instructor)：冯耀宇论文题目（Topic/Title）：基因治疗发展与应用论文要求与评价标准：(Requirementsandcriteria)1、选题与本课程方向相符，体现学术性和应用价值。2、文章格式规范、逻辑性强。3、篇幅不少于5000字。4、参考文献格式符合华东理工大学学报的著录规范要求。原则上应该大于20篇，英文文献应该大于15%5、学术讲座报告应该说明参加读书报告的情况说明，以及本报告与学术报告的关系。6、应该有结论或结束语。教师评语：(Comments)教师签名(signature)：年月日基因治疗发展与应用王璐（华东理工大学资源与环境工程专业上海200237）摘要：基因注定是21世纪的生命科学的舞台上的主角，本文对基因治疗做详细的解释，简述其基本程序和步骤。详细介绍其产生及发展历程，举例说明基因治疗的应用情况，并概述其存在的问题与发展前景展望。关键词：基因治疗；发展历程；应用0前言传统的治疗手段包括药物治疗，手术治疗，物理治疗。由于基因分子生物学理论和技术的重大发展，上个世纪90年代，出现了新的治疗手段——基因治疗。其将外源基因导入靶器官、组织或细胞，通过其表达产物，显示生物学效应，防治疾病。是一种改变细胞遗传物质为基础的治疗。基因治疗是基因时代医学的重要内容，也是21世纪治疗学革命的重要组成部分。1基因治疗的介绍1.1基因治疗的定义基因治疗狭义上指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。广义上指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法[1]。1.2基因治疗的三要素基因治疗是一个生物医学高技术密集的领域，它综合应用分子生物学、分子遗传学、分子病毒学、细胞生物学等学科的最新研究成果，来治疗那些目前尚无好的治疗方法的顽疾。尽管基因治疗的技术复杂，方法多样，但它的组成要素不外乎三个：目的基因、表达载体、递送载体[2]。第一个要素是目的基因或称治疗用基因，已经完成的人类基因组计划，其任务之一就是为基因治疗建立一个庞大的基因库，为各种疾病的治疗提供源源不断的有用基因。第二个要素是携带基因进入细胞内表达的载体，简单易行基因转移方式。包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体中又分腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒载体等；非病毒载体包括脂质体、磷酸钙、基因枪等。第三个要素是靶细胞。治疗基因必须通过靶细胞发挥作用，完成基因正常表达和调控。1.3基因治疗的主要分类[3]1.3.1按基因操分为基因修正（genecorrection）和基因置换（genereplacement），即将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologousrecombination）即基因打靶基因治疗（genetargetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强（geneaugmentation）和基因失活（geneinactivation），是不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达。1.3.2按靶细胞又可分为生殖细胞（germ-linecell）基因治疗和体细胞（somaticcell）基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以精子，卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于当前基因治疗技术还不成熟，以及涉及一系列伦理学问题，生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞。1.3.3按给药途径①exvivo途径：这是指将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞（或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。exvivo基因转移途径比较经典、安全，而且效果较易控制，但是步骤多、技术复杂、难度大，不容易推广；②invivo途径：这是将外源基因装配于特定的真核细胞表达载体，直接导入体内。这种载体可以是病毒型或非病毒性，甚至是裸DNA。invivo基因转移途径操作简便，容易推广，但目前尚未成熟，存在疗效持续时间短，免疫排斥及安全性等一系列问题。1.4基因治疗策略基因矫正：纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。基因置换：指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA完全恢复正常状态。基因增补：把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去基因失活：将特定的反义核酸（反义RNA、反义DNA）和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。自杀基因：在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”。免疫治疗：免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等。耐药治疗：耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1。1.5基因治疗的对象基因治疗的研究对象也已由原来的遗传病扩展到肿瘤[4]、传染病和心血管[5]等疾病，而且研究的重点已转移到肿瘤基因治疗方面[6]，另外基因治疗方法还可以用于遗传免疫方面[7]，预防病毒性疾病和肿瘤，如将病毒抗原基因(HbsAg)及一些肿瘤抗原基因(CEA)直接注射到人体内；基因治疗不仅可以用于儿童、成人的疾病治疗，还可以用于孕妇腹中患病的胎儿，让疾病消失在胎儿出生之前。基因治疗还可用于人类亚健康状态的治疗，如肥胖、秃顶、疲劳、衰老等[8]。①恶性肿瘤：肿瘤的发生是由于化学毒物、射线等环境因素诱发细胞的基因调控异常所致的疾病，通常伴有多种基因的改变。恶性肿瘤是危害人类健康最为严重的疾病之一。它不仅给人们的精神上带来极大痛苦，还给社会造成巨大的经济负担。因此，恶性肿瘤长期以来一直是医学界关注的焦点、力图攻克的难关。②心血管疾病：随着人们生活水平的提高，心血管疾病的死亡率逐年增高。深入的研究表明，心血管疾病是一种多基因遗传病，所以心血管病的基因治疗越来越引起人们的关注，成为继肿瘤基因治疗之后的又一研究热点。③其他：如遗传病，AIDS等严重威胁人类安全和健康的疾病。2基因治疗的基本程序和步骤2.1基因转移的基本程序(一)治疗性基因的获得(二)基因载体的选择(三)靶细胞的选择(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内2.2基因转移的基本步骤所谓基因转移技术就是将外源性的目的基因（包括基因组DNA，克隆化的基因及寡核苷酸片段等）通过特定的方法引入受体生物或细胞，并检测其在转化细胞中表达结果的一种生物学技术。通常这一技术运用在微生物（细菌、酵母等）和植物细胞时被称之为转化，而运用于动物细胞时则被称为转染。根据外源基因转移时使用的介质不同，可将其大致分为物理学法、化学法、生物学法[9]。2.3.1转移基因治疗在基因治疗中迄今所应用的目的基因转移方法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法。基因转移的病毒方法中，RNA和DNA病毒都可用为基因转移的载体。常用的有反转录病毒载体和腺病毒载体。转移的基本过程是将目的基因重组到病毒基因组中，然后把重组病毒感染宿主细胞，以使目的基因能整合到宿主基因组内。非病毒方法有磷酸钙沉淀法、脂质体转染法、显微注射法等。2.3.2表达目的基因的表达是基因治疗的关键之一，为此，可运用连锁基因扩增等方法适当提高外源基因在细胞中的拷贝数。在重组病毒上连接启动子或增强子等基因表达的控制信号，使整合在宿主基因组中的新基因高效表达，产生所需的某种蛋白质。2.3.3安全措施为避免基因治疗的风险，在应用于临床之前，必须保证转移-表达系统绝对安全，使新基因在宿主细胞表达后不危害细胞和人体自身，不引起癌基因的激活和抗癌基因的失活等，尤其是在将反转录载体用于基因转移时，必须在应用到人体前预先在人骨髓细胞、小鼠体内和灵长类动物体内进行类似的研究，以确保治疗的安全性。3基因治疗进程3.1基因治疗的发展历程基因治疗的设想早在20世纪60年代就有人提出，而将遗传物质导人人体细胞中以治疗疾病的最初尝试是在70年代的早期，但是，试验未获成功，不过也未出现副作用，因此并没有引起人们太大的关注[10]。1980年，人类进行了第一例真正的基因治疗尝试，主持试验工作的是美国的马丁·克赖恩教授。克赖恩虽然开了临床基因治疗研究的先河，可是由于事先未征得美国国立卫生研究院的批准，算是违规。自1980年至1989年，从学术界到宗教、伦理、法律各界，对基因治疗能否进入临床存在很大争议。直到1989年美国才批准了世界上第一个基因治疗临床试验方案，当然这不是一个真正意义上的基因治疗，而是用一个示踪基因构建一个表达载体，了解该示踪基因在人体内的分布和表达情况。到了1990年，美国NIH的FreuchAnderson博士开始了世界上第一个真正意义上的基因治疗临床试验，他们用ADA（腺苷酸脱氨酶）基因治疗了一位因ADA基因缺陷导致严重免疫缺损的4岁女孩，并获得了初步成功，促使世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮[11]。2000年，法国巴黎内克尔(Necker)儿童医院利用基因治疗，使数名有免疫缺陷的婴儿恢复了正常的免疫功能，取得了基因治疗开展近十年来最大的成功[12]。2004年1月，深圳赛百诺基因技术有限公司将世界上第一个基因治疗产品重组人p53抗癌注射液（商品名：今又生）正式推向市场，这是全球基因治疗产业化发展的里程碑[13]。3.2全球基因治疗临床试验情况[14]自从1990年美国FDA正式批准第一个基因治疗临床试验以来，世界各国都掀起了基因治疗的研究热潮。截止到1995年，全世界共有100多个基因治疗临床方案，在美国NIH主持的评估中发现真正有效的方案仅几个，从而提出必须加强基因治疗中的关键基础问题的研究，加强了对基因治疗临床试验方案的审批和监管力度。从此，基因治疗从狂热转入理性化的正常轨道，并一直在稳健地发展。据统计，截至2004年6月底，全世界范围内基因治疗的临床试验方案已有987个，表明基因治疗具有良好的发展前景。在所有的临床试验方案中：(1)恶性肿瘤占全部基因治疗临床试验方案的首位，占总数的66%；(2)心血管疾病占全部基因治疗临床试验方案的8.1%；(3)单基因疾病占全部基因治疗临床试验方案的9.4%；(4)感染性疾病，主要是艾滋病(AIDS)占全部基因治疗临床试验方案的6.6%；(5)其他疾病占全部基因治疗临床试验方案的2.9%；(6)基因示踪占全部基因治疗临床试验方案的5.3%。目前这些基因治疗临床方案大多数处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段，其中Ⅰ期临床方案有624个，Ⅰ/Ⅱ期204个，Ⅱ期131个，Ⅱ/Ⅲ期11个，Ⅲ期17个。目前只有我国的重组腺病毒——p53抗癌注射液（商品名“今又生”）作为世界上第一个基因治疗产品正式上市，这不仅标志着我国能够在“点”上取得世界性的科技突破，也意味着我国有能力在生物高技术产业化进程中抢占先机。总的来说，在基因治疗基础研究和临床试验及产业化各个领域，美国均领先于世界，其临床方案有662个，占世界上总数的67%。3.3我国基因治疗发展现状[14]与美国及欧洲相比，我国基因治疗基础研究和临床试验开展得较早，起点也不低。早在20世纪70年代，吴旻院士就对遗传性疾病等的防治提出了基因治疗的问题。1985年，他再次撰文指出基因治疗的重要目标是肿瘤。我国是世界上较早开展基因治疗临床试验的国家，基因治疗基础研究和临床试验基本与世界同步，复旦