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发酵调控学生物工程学院储炬课程内容1微生物生长分化调节的规律(1)细胞周期内有关生长的活动，DNA合成与细胞分裂的调节(2)丝状菌生长分化的调节2初级代谢的调节机制(1)调节的生化基础(2)代谢调节的方式与内容：诱导、分解代谢物调节、反馈调节课程内容3次级代谢物的生物合成的调节(1)次级代谢物的概念(2)生物合成的前体(3)次级代谢物的生物合成(4)抗生素生物合成的控制课程内容4发酵过程控制(1)控制的策略(2)参数的指导作用(3)参数相关分析(4)过程控制的评价主要参考书现代工业发酵调控学，储炬，李友荣，化学工业出版社，北京。2002年1月Biotechnology,2nded.Vol.1;BiologicalFundamentals.RehmH-JBBiotechnology,3ndedVol.3;Bioprocessing.RehmH-JB绪论一、发酵调控学开设的必要性、目的意义全称：发酵过程微生物的内在调节与外部控制发酵工艺向来被认为是门艺术而不是科学，完全凭经验操纵。尽管生物系统发酵过程极其复杂，但由于有许多相关学科(生物化学、分子遗传学、计算科学)的迅速发展，有可能把一些表面现象和菌的内在本质联系起来。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术代谢调控学是生物工程中的重要研究方向，是进行过程优化的基础。其内涵及研究深度也随着生物技术的飞速发展而扩增，会派生出新的分支，如代谢工程等。只有深入研究微生物的内部调节规律和体内各种反应的启动、中止、前后连接、耦合的次序及方式，充分了解微生物的代谢调节规律，掌握微生物生理和代谢的协调，才能打破其固有的遗传守恒，充分表达其潜在的遗传型。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术世界上借助细胞培养的产品已占生物技术的40％以上，达数百亿元的产值。要提高生产水平，无不涉及到细胞代谢与及其调控的研究。由此生产的抗生素、氨基酸、维生素等在整个医药产品中占很大比例。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术膜过滤发酵与分泌机制的研究都是围绕如何除去对产物合成有害的代谢物，与避开终产物的反馈调节作用。膜过滤与发酵耦合成功地应用于解除对产物合成的不利作用，导致葡萄糖氧化酶的总产量提高2倍；利用超声波等因素促进产物的分泌，使庆大霉素发酵单位提高1.7倍。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术目前大量生物技术已从实验室成果走向产业化，特别时基因工程药物、疫苗、单克隆抗体等进入商品化阶段，成为国民经济重要的支柱产业。由于生物过程特点表现在检测参数的多样性，相关耦合性，时变性，如果进一步与实验室手工参数结合，就可对过程工艺进行深入分析。过程优化为目标的相关参数分析与控制发酵是各种生化反应的综合过程，只要某一因素成为限制条件，就会对生产产生严重影响。如何认识和发现这些限制因素就成为重要的研究课题。必须从物料或能量流的变化才能发现其中的本质。发酵过程调控与计算机在线传感控制相结合，达到过程优化。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术我们在红霉素发酵生产过程优化研究中，把生物反应器的物料流与细胞内的代谢流结合起来，进而把发酵过程的生理调控研究与发酵过程优化控制联系起来，发现了许多长期以来有经验总结但又无法进一步解释的现象，在15L规模达到了发酵水平提高60％以上的幅度。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术在向生产规模放大时，提出了放大后的差异以参数相关理论从工艺上调整给补的方法，实现了从15L直接成功地放大到50M3规模。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术在毕赤酵母表达重组人血清白蛋白时，研究了以甘油为基质的菌体生长阶段和以甲醇诱导产物表达阶段的物料流变化特性，进而解决了由于高密度培养所引起的供氧问题，在50L发酵罐规模从数百mg/L的水平提高了数十倍，并进一步放大到500L规模，避免了通纯氧问题。最近在肌苷、鸟苷发酵研究方面又取得的突破，也是在这些理论指导下取得的。微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术代谢调控是研究内在的调节机制，而过程优化则是外在控制，是建立在相关参数的分析上的，这两个方向相辅相成，前者为后者的基础，而后者是使理论变为现实的手段。二十一世纪的生命科学RenewablerawmaterialsBiofuelsBiomaterialsChemicalsCellFactoryIndustrialbiotechnology:GatewaytoamoresustainablefutureFigure1.Idealizedbiorefineryconcept.(ImagecourtesyofOakRidgeNationalLaboratory,OakRidge,TN,USA.)1微生物生长与调节为了控制菌体的生长，需要了解生长的方式，细胞分裂和调节的规律，测量微生物生长的各种办法，微生物生长繁殖的形式与工业生产的关系，环境变化对微生物生长的影响。因此，研究微生物的生长分化规律无疑是发酵调控原理的一个重要组成部分。细胞周期对于个体细胞行为，主要关心染色体启动、复制和分离新细胞壁材料的合成与插入协调染色体复制和细胞分裂的信号细胞周期细胞周期(Cellcycle)：细胞的一系列可鉴别的周而复始的生长活动。这些活动的顺序不变,完成一个活动后才能进行下一个活动。图1细胞周期细胞周期典型的真核生物细胞周期如图所示:S,M和G1,G2分别代表DNA合成,有丝分裂期和两次间隙。若生长速率因养分多寡而改变,S,G2和M几乎不变,只有G1改变。MTG:meangenerationtime细胞周期原核生物在低生长速率下的细胞周期,与真核生物相似。其染色体复制期C相当于S；细胞分裂期D相当于G2+M；C和D不随生长速率变化,只有G1可变动。细胞周期的各项活动怎样去适应生长速率变化的需要？染色体复制与细胞分裂的调节染色体复制怎样与细胞分裂协调？在高速生长下,如细胞周期为30min,染色体复制不能在一个周期内完成。为此，未等前一轮复制结束，后一轮复制又在原点上启动。可以把C期的启动和终止,以及细胞分裂看作是不可更改的活动顺序,称为C+D周期。染色体复制与细胞分裂的调节若增代时间少于C+D时间,C+D周期重叠，其重要特征是分配到子细胞的染色体已开始新的一轮复制。这类染色体称为二叉染色体(dichotomous)。图2大肠杆菌的染色体复制和细胞分裂的时间分配示意图染色体复制和细胞分裂的调节规律染色体复制未完成，细胞就不会分裂。不管生长速率如何，大肠杆菌的细胞分裂总是出现在染色体复制完成之后。不管生长速率如何，C和D所需时间大致不变。C和D可以依次或同时(指上一轮的D和下一轮的C)进行。思考题加倍时间最小为多少？C＝40，D＝20时，时间如何分配？染色体复制的启动染色体复制的启动受启动因子(origin),一种特异调节性蛋白的正向控制。当启动因子增加到某一临界水平,启动便开始。在这以后启动因子被毁或稀释。合成启动因子达到有效浓度所需的时间恰好等于培养物增代时间。染色体复制的启动大肠杆菌在启动时的启动因子数量与细胞质量之比在各种生长速率下是一样的。这一比例实际上是染色体启动因子的浓度。细胞似乎能检出启动因子的浓度。当它达到一临界值时便启动新一轮的复制。启动的直接后果是启动因子的浓度提高一倍。染色体复制的启动启动不会重新发生直到其浓度因生长而降到临界值。这种控制机制构成一种生物钟。它是以细胞体积或其它有关参数为依据。据此，染色体复制的启动频率是DNA合成速率的控制步骤。染色体复制的启动O/M=I启动，启动后，2O/M=I’,I’I不再启动，M增加，M2M，使I’逐渐下降，2O/2M=O/M=I，又开始启动。启动和复制是性质截然不同的两种过程启动的过程需要蛋白质合成，如蛋白质合成受阻，已启动的DNA合成能完成，但不能启动新一轮DNA合成。曾检出其产物负责启动而不负责随后复制的基因；；加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白质合成或除去营养缺陷型所需的氨基酸都能阻止启动，但允许复制继续完成；培养物进入稳定生长期后，中止生长的细胞含有完整的染色体。染色体复制的启动启动总是在染色体上的专一位置上进行。此位点称为复制或染色体原点。在大肠杆菌此位点很靠近ilv座位。在大肠杆菌和枯草杆菌中复制叉以两个方向沿染色体运行，大约在离原点180度地方相遇。染色体复制的启动启动的频率取决于细胞量增长的速率，即生长停止，启动也随着停止是预料中的事。细胞周期的研究方法1镜检法用电子显微镜观察单个细胞的生长，定时拍照。由此发现大肠杆菌在分裂时细胞个子的变化不大。细胞周期的研究方法1镜检法说明似乎存在一种控制细胞个子大小的因子，即尺寸因子(sizefactor),可能是启动细胞质量(initiationmass)。1镜检法缺点:细胞由培养液转移到固体表面,会受到干扰。细胞年龄变化较大时,细胞大小变化不大。2同步培养(Synchrony)法(1)密度梯度离心沉降法按细胞的大小/年龄把在对数生长期的培养物分级。H2O/D2O密度梯度沉降法:能应用于任何品种,不会施加渗透压强的影响。从某一密度带便可分离出同质的细胞群体，随后培养。细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系蛋白质合成速率与细胞长度(体积)成正比，从而与细胞年龄成正比。(2)过滤洗脱法将细胞粘附在固体支持物，如硝化纤维膜上，然后将其倒置，让生长培养基从上到下通过，新生的细胞便被洗脱到培养基中，呈一种特征性的振荡模式，见图1－23。过滤洗脱法(2)过滤洗脱法在初始冲洗(wash-off)期后从滤膜上洗脱下来的主要是新分裂的细胞。在洗脱曲线高峰下从膜上洗下的细胞是沉积在膜上的新生细胞后代，那些在低峰下的是其沉积时正要分裂细胞后代。过滤洗脱法洗脱(wash-off)的振荡模式可以测出细胞周期。3同位素示踪法如亲本培养物沉积在滤膜上之前用氚标记的胸苷使细胞带上标记，则结合到洗脱细胞的标记量与结合到亲本培养物那一年龄细胞的标记量成正比。细胞周期细胞周期其一个洗脱峰(后代)带有比前一代少一倍的放射性标记。可以分别求得C和D值3同位素示踪法另一种研究细胞周期的方法是通过蔗糖密度梯度离心，使一对数生长的培养物沉淀,收集最上层的细胞，在含有氚-标记胸苷的生长培养基上生长，测量其DNA合成速率。3同位素示踪法洗脱前在无标记培养基中生长，洗脱时用带标记的培养基，得到的带标记DNA呈阶梯上升状。细胞周期4生长速率与细胞个子大小的关系生长培养基越丰富，细菌生长速率加快，其细胞的个子也越大。如在同一种培养基内改变温度也会影响生长速率，但对细胞个子大小几乎没有多大影响。4生长速率与细胞个子大小的关系如一细胞的增代时间为60min，在细胞分裂结束时染色体复制便开始启动。假设细胞这时具有质量为M(启动细胞量=1/启动因子浓度)。4生长速率与细胞个子大小的关系个体细胞的量在指数地增加，直到2M，细胞便开始分裂。此时从培养液中检出新生的细胞，置于较丰富的培养基(能使菌快速生长,增代时间为35min)中，并假定细胞迅速调整到新的生长速率。4生长速率与细胞个子大小的关系这样，个体细胞量增长速率往上移动，如C+D规律还适用，下一个细胞分裂的时间不会变动，但细胞个子会增大。新一轮复制的启动将在细胞分裂前便开始。4生长速率与细胞个子大小的关系换句话说，C+D周期现在开始重叠。快速生长经一个细胞周期后便达到新的平衡。生长速率越快，细胞个子的差异也越大。生长速率对细胞个子和染色体复制启动时间的影响生长速率对细胞个子和染色体复制启动时间的影响可用式1-27表示细胞周期t对指数培养物的细胞个子平均大小M的影响。M=K2(C+D/t)(1-27)曲线的形状将取决于C，D和K是否变，只有在简单情况下logM与t作曲线才会得一直线。细菌培养物的生长周期在一来自静止期细胞的培养物的生长期间，在细胞数目开始增加以前有一相当长的停滞期。细胞量开始增长的滞后现象短一些。细菌培养物的生长周期如达到物态的指数生长，则所有可测的参数也将平行地增长。当培养物进入静止期便发生与上述‘相’反的活动顺序。因启动速率比细胞分裂早减速C＋D分钟。细胞量增长下降时，