RNA干扰的研究进展-赵碧-第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集-2010

文献综述201而没有自己的测序仪呢，这些高端技术为什么总是无法从我们手中创造出来？这些高通量测序仪都是高技术的结晶，它需要整合各个学科的高端技术，这里面有材料科学、微电子物理、物理化学、生物物理、生物化学、生物信息学等等，没有一个庞大有机的组合是不行的，没有大量的物力财力支持也是不行的，因此这需要政府足够的重视，设置牵头单位，发挥我国航天精神，组合多家单位共同攻关，这样总会创造出我们自己的国际一流的测序仪。参考文献（略）RNA干扰的研究进展赵碧，文明1,2（1.贵州大学，动物科学学院，贵州贵阳，550025；2.贵州省动物疫病研究室，贵州贵阳，550025）摘要RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指由双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）启动的序列特异的转录后基因沉默现象，广泛存在于真菌、植物和动物中。它是细胞内由双链RNA诱导降解与其配对的特定mRNA的过程。细胞内双链RNA在酶的作用下，形成20-25碱基大小的小干扰RNA（siRNAs），由siRNAs进一步掺入多组分核酸酶并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，抑制该基因在细胞内的翻译表达。RNAi技术是近年来迅速发展起来的高效、特异、易操作的基因沉默技术。与反义寡核苷酸等传统方法相比，RNAi技术有着无可比拟的优势。该文就RNA干扰技术的历史、作用机制、生物学特点及应用作简要概述。关键词RNAi；siRNA；基因沉默美国科学家Fire和Mello于1998年发表论文，公布了有关RNA干扰（RNAinterferenceRNAi）机制的发现并因此获得2006年诺贝尔医学奖。以他们的发现为基础，RNA干扰技术近年来迅速兴起，其前景被普遍看好。RNA干扰是一门新兴的基因阻断技术，是一种双链RNA（double-strandedRNA,dsRNA）分子在mRNA水平上关闭相应序列基因的表达或使其沉默的过程，也就是序列特异性的转录后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing,PTGS）。它通过21－23nt的dsRNA或发夹状RNA（shorthairpinRNAs,shRNAs）与特异性mRNA结合导致靶基因的降解，进而导致目的产物表达的下调[1-5]。外源dsRNA进入细胞后产生的小分子干扰RNA（smallinterferingRNA,siRNA）的反义链和多种核酸酶形成了沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），RISC通过结合和切割mRNA的作用而介导RNA干扰的过程[1]。1RNA干扰的发现1995年，康奈尔大学的Guo等在利用反义RNA技术试图阻断秀丽线虫par-1基因表达时，发现给对照实验组线虫注射正义RNA后，结果产生了与反义RNA同样的结果——特异性阻断该基因的表达。这与传统上反义RNA技术的解释正好相反。当时，该研究小组一直未能对这个发现给予合理解释。直到1998年，华盛顿卡耐基研究所的Fire等对此进行了深入的研究，他们把将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注射线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达，其抑制基因表达的效率比纯化后的反义RNA至少高2个数量级。他们认为Guo等发现的正义RNA对基因表达的抑制，是由于在体外转录制备正、反义RNA过程中污染了微量的双链RNA所引起的[6]。他们称此现象为RNA干扰。随后RNAi现象被广泛地发现于果蝇、原虫、植物、真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中[7]。Paul等[8]在实验中发现哺乳动物细胞（如人胚肾细胞、Hela细胞等）同样存在RNAi效应。从而通讯作者：文明（1969-），男，苗族，博士，教授，硕士生导师。研究方向:动物传染病学与预防兽医学。E-mail:[e-mail]作者简介：赵碧（1991-），男，白族，云南曲靖人，硕士，主要从事分子免疫学研究。E-mail:[e-mail]第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集202提示低等生物与高等生物中均可发生RNAi，RNAi可能是生物体进化过程中的一种保守机制。生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染阻断转座子的作用。2RNAi的作用机制对于RNAi的作用机制目前认为有两种：一种是存在于线虫、真菌和植物中依赖RdRP的干扰途径，另一种是存在于果蝇和哺乳动物中不依赖RdRP的干扰途径。对于线虫、真菌和植物来说，dsRNA在RNaseIII的作用下被切割成primarysiRNA，这些siRNA一部分形成RISC来识别并切割靶mRNA；另一部分作为引物在RdRP的催化下以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，这些dsRNA被RNaseIII切割成更多的secondarysiRNA，从而达到足够的浓度诱导RNAi[9]，因此RNA干扰只需要少量的siRNA。用Blast搜索果蝇和人的基因组序列没有发现与RdRP同源的。外源性siRNA介导的RNAi在人细胞中持续的时间比较短，表明siRNA没有被扩增或拷贝。实验研究也证实，哺乳动物中siRNA不能作为RdRP扩增RNA的引物，因此推测发生在果蝇和人类细胞中的RNAi属于非RdRP依赖的。RdRP即RNA依赖的RNA聚合酶，它能识别异常RNA并以其为模板合成dsRNA分子，还可以siRNA反义链为引物，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，因此与沉默信号的放大有密切关系。目前认为基因沉默信号放大效应存在以下机制：RISC可多次重复利用，使得RNA沉默通路的昀后一步效率大大提高；即上述RdRP的作用；转移性RNAi（transitiveRNAi）。由于secondarysiRNAs可能和靶mRNA上游的一些基因同源，产生这些基因被干扰的现象，称为转移性RNAi。目前未发现人和果蝇中存在transitiveRNAi的现象，可能与RdRP的缺失有关。Drosha和Dicer是RNaseIII家族的成员，RNaseIII是dsRNA特异性核酸内切酶。Drosha含相继的两个RNaseIII（RIIIa和RIIIb）域和一个dsRBD域，以及一段未知功能的氨基末端延伸区域，主要介导细胞核内约70nt具有茎环结构的pre-miRNA的形成[10]，pre-miRNA在Ran-GTP依赖的转运蛋白Exportin5的作用下，从核质运输到胞质中[11]，在Dicer酶的作用下被剪切成约22nt的双链miRNA。Dicer通常包括1个解螺旋酶的结构区域，1个DUF283（domainofunknownfunction283）域，1个PAZ（PiwiArgonauteZwille）域，相继的2个RNaseIII域和1个dsRBD域，主要介导miRNA和siRNA的形成，其中PAZ域含有1个OB（oligonucleotide/oligosaccharidebinding）折叠，用以识别Drosha剪切产物末端单链突出的2个核苷酸，并将RIIIb域定位在pre-miRNA的茎部[12]。植物中没有Drosha酶，但在拟南芥中发现存在4种Dicer的同源蛋白（Dicer-likeprotein）：DCL1、DCL2、DCL3和DCL4。DCL1主要与miRNAs的产生有关，DCL2参与病毒防御以及siRNAs的生成，DCL3产生的siRNA参与染色质修饰，DCL4产生的siRNA参与植物生长发育[13]。果蝇存在2种Dicer同源蛋白：Dicer1（DCR1）和Dicer2（DCR2），其中Dicer1含有PAZ域，负责催化pre-miRNA的产生；而Dicer2缺失PAZ域，它与siRNAs的生成有关[14]。虽然Dicer酶具有独立的催化活性，但在发挥作用时还需要其它蛋白的辅助。线虫中DCR1是通过识别结合有RDE-4的dsRNA完成切割作用的，RDE-4蛋白含有两个dsRBD域，只能识别外源性的dsRNA，提示它与siRNA的生成有关。果蝇中DCR2是和R2D2蛋白（twodsRBDsandassociatedwithDCR-2）一同起到活性作用的，R2D2与RDE-4同源，也包含有两个dsRBD域，分子量约为36ku[15]。研究表明功能对称（functionallysymmetric）的siRNA的两条链都可以诱导RNAi[16,17]，实际应用中为了干扰的高效和专一性，往往需要反义链诱导的RNAi，所以合成都是一些功能非对称性的siRNA。所谓功能对称和非对称，是通过两个5’端热力学稳定性差异（thermodynamicdiffercence）体现的，具体来说5’端热力学不稳定的ssRNA更倾向于诱导RNAi[18]。R2D2可以感应这种稳定性的差异，并通过dsRBD与热力学较稳定的5’端结合，这种结合也包含有DCR2，三者的复合体称为RCL（RISCloadingcomplex），复合体中siRNA开始解螺旋，并开始有其它蛋白参与形成RISC，从而降解靶序列，诱导RNAi[19]。成熟的miRNA与其互补序列结合成miRNA：miRNA双螺旋结构，其中miRNA靠近5’端有一个小的发夹结构，较不稳定，因此这条链更倾向于诱导基因沉默，而另一段则被降解[20]。RISC由RNA和蛋白质两部分组成，蛋白质部分的核心成分是Argonaute蛋白。不同物种中存在多种Argonaute同源蛋白，如线虫中RDE-1，果蝇中的AGO-1、AGO-2和Aubergine，锥虫中的TbAGO1和TbPWI1，人体细胞中的PIWI亚族和eIF2C/AGO亚族等。线虫中的RDE-1蛋白促进dsRNA与RDE-4的结合，形成一个RDE-1/RDE-4/DCR-1/DRH-1的复合体对dsRNA进行处理，然后将得到文献综述203的siRNA传递给RISC。果蝇中的AGO-2蛋白属于PPD（PAZandPIWIdomains）蛋白家族，含有一个氨基端的PAZ域和一个羧基端的PIWI域，分子量约为100ku，主要负责siRNA诱导的基因沉默。PIWI域存在于原核和真核生物中，序列高度保守，结构类似与RNaseH，负责靶mRNA的酶切降解[21]。果蝇的AGO-1蛋白对于siRNA的作用意义不大，但对于miRNA的作用是不可缺少的[22]。人的Ago2蛋白（hAgo2）与siRNA和miRNA的作用关系密切，而Ago1、Ago3和Ago4则影响不大[23]。除PAZ和PIWI结构域之外，在锥虫的TbAGO1中还发现N末端存在一个富含RGG的序列，该结构域的缺失也会影响到mRNA的切割[24]。RISC中还存在其他一些功能未知的组分，如果蝇的VIG、dFXR、Tudor-SN和Armitage，人体中的FMRP（fragileXmentalretardationprotein）、FXR1和FXR2，线虫中的MUT7和RDE-3，RISC发挥作用还需要ATP的参与，这其中至少包括两步：dsRNA切割成为siRNAs过程需要ATP；RISC复合体中siRNA双链的解螺旋需要ATP。3RNAi的生物学特点3.1特异性RNAi是转录后水平的基因沉默机制，有高度的序列特异性，这使dsRNA能够非常特异地诱导与之序列同源的mRNA降解，避免降解与目的mRNA同家族的其它mRNA，从而实现对目的基因的精确沉默[25]。3.2选择性外源性dsRNA的转入只对成熟mRNA产生作用，对mRNA前体没有或很少具有影响，以内含子或启动子序列构成的外源dsRNA无法引起RNAi效应；dsRNA的长度对RNAi的效率有影响。3.3高效性只需少量dsRNA的引入便可抑制浓度是几倍甚至几十倍的mRNA的降解[26]。可能的原因：RNAi存在级联放大效应[27]。相比普通的siRNA，shRNA产生的RNAi效应更强；可能与RdRP的作用有关，即在RdRP的作用下，dsRNA得以复制，从而产生更多的dsR