荧光分析法

分析化学Ⅱ第十一章荧光分析法分析化学教研室荧光分析法（Fluorometry)概述荧光定量分析方法荧光分析技术与应用基本原理小结11.1概述水溶性荧光黄无辐射跃迁放出热能或动能物质基态光照射激发态光致发光发射荧光和磷光物质基态吸收特定光荧光分析法：基于对化合物的荧光测量建立起来的分析方法荧光测量包括：荧光谱线位置及荧光强度续前荧光可见紫外相同点分子光谱分子光谱不同点本质发射光谱吸收光谱灵敏度10-8~10-10g/ml10-5~10-7g/ml选择性高一般荧光分析法与可见紫外吸收光谱比较激发光源荧光分析法紫外－可见光分子荧光法（MolecularFluorometry)X射线X射线荧光法（X-rayFluorometry)原子特征谱线原子荧光法（AtomicFluorometry)荧光分析法分类：根据光源不同进行分类返回11.2基本原理11.2.1分子荧光光谱的产生11.2.2激发光谱与发射光谱11.2.3分子结构与荧光的关系11.2.4影响荧光强度的外部因素11.2.1分子荧光光谱的产生一、分子能级与电子能级的多重性单重态：singletstate三重态：tripletstate分子的能级包括：电子能级（10ev）、振动能级(0.1ev)及转动能级(0.001ev)电子能级的多重性M:M=2S+1；S为总自旋量子数10)21(212121MS多重性总自旋量子数和自旋量子数分别为两电子自旋方向相反，3121212121MS多重性总自旋量子数和自旋量子数分别为两电子自旋方向相同，续前ABC单重态和三重态电子分布能量ππππ*π*π*A：基态单重态B：激发单重态C：激发三重态激发三重态T激发单重态S*基态单重态S0跃迁类型的比较续前跃迁类型基态→激发单重态S*基态→激发三重态T*所需能量大小自旋方向不变改变跃迁几率接近于110－6（光学禁阻）二、荧光的产生续前处于激发态的分子返回到基态共有以下几种途径：辐射跃迁荧光磷光回基态途径内部能量转换体系间跨越振动弛豫外部能量转换无辐射跃迁1236451、振动弛豫（vibrationalrelexation）续前过程：从电子激发态的某一振动能级以非辐射跃迁的方式，回到同一电子激发态的最低振动能级的过程为振动驰豫特点：发生在同一个电子能级内不同振动能级间的跃迁；时间约10-12秒。或返回2、内部能量转换（internalconversion)续前过程：当两个电子的能级非常靠近，以致其振动能级有重叠时，电子常常由高电子能级以非辐射跃迁方式转移至低电子能级，这种过程称为内部能量转换特点：发生在非常靠近的两个电子能级间，他们的振动能级有重叠；时间约10-1～10-13秒。或续前处于激发态的电子，通过振动弛豫和内部能量转换，均回到第一激发态的最低振动能级过程：振动弛豫→内部能量交换→振动弛豫返回注：3、体系间跨越（intersystemcrossing)续前过程：处于激发态的电子自旋方向发生改变，而使电子能级的多重性发生变化的过程特点：激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，产生体系间的跨越（S1*→T1）。结果：这种跨越会导致荧光强度减弱，甚至熄灭。续前影响体系间跨越几率增大的因素：含重原子的分子（如碘、溴等），体系间跨越最为常见。在溶液中存在氧分子等，这些顺磁性物质也能增加体系间跨越的发生几率。原因：高原子序数的原子中，电子的自旋与轨道运动之间的相互作用较大，有利于电子自旋反转的发生。返回4、荧光（fluorescence）续前过程：电子由单重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发射的光量子为荧光特点：发生在激发单重态最低振动能级与基态之间。时间约为10-7～10-9s。注：发射荧光的能量比吸收的能量小10即发射波长激发波长硫酸奎宁的激发光谱和荧光光谱激发光谱荧光光谱激发光谱荧光光谱返回5、磷光（phosporescence）续前过程：电子由三重态的第一激发态最低振动能级跃迁到基态的任一振动能级而发射的光量子为磷光特点：发生在激发三重态最低振动能级与基态之间。分子在三重态的最低振动能级上可以存活一段时间，发射时间约为10-4～10s。注：发射磷光的能量比荧光的能量小210即磷光波长荧光波长激发波长续前荧光与磷光的比较荧光磷光跃迁激发单重态最低振动能级→基态激发三重态最低振动能级→基态光电子能量E激发＞E荧光＞E磷光波长λ激发＜λ荧光＜λ磷光发射时间10-9~10-7秒10-4~10秒返回6、外部能量转换（externalconversion)续前过程：如果分子在溶液中被激发，激发分子之间、分子与溶剂之间会发生碰撞而失去能量，这种非辐射跃迁的过程称为外部能量转换特点：发生在激发态的最低振动能级和基态之间；所需时间约为10-7～10-9秒。结果：导致荧光或磷光减弱，甚至熄灭或续前返回返回211.2.2激发光谱与发射（荧光）光谱激发波长发射波长——荧光物质分子的两个特征光谱激发光谱(excitationspectrum)：F~ex荧光光谱(fluorescencespectrum)：F~em（二）激发光谱与荧光光谱激发光谱：（与吸收光谱类似）表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光所得的光谱。方法：固定发射光波长λem，依次改变激发波长λex，测荧光强度F，以F-λex作图得荧光物质的激发光谱。发射光谱：（荧光光谱）固定激发光波长λex，依次改变发射波长λem，测荧光强度F，以F-λem作图得荧光光谱。激发光谱与荧光光谱上的λmax是定性定量的依据荧光光谱的特点（重点）（1）斯托克斯位移：荧光发射波长总是大于激发波长。原因：无辐射跃迁能量损失，包括振动弛豫和内部能量转换等（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关原因：电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光(如图)。（3）荧光发射光谱与激发光谱的镜像关系通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。蒽的激发光谱和荧光光谱S0S1*ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0ν=4ν=3ν=2ν=1ν=0b4b3b2b1b0c0c1c2c3c4ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1ΔE4ΔE3ΔE2ΔE1蒽的能级跃迁图镜像关系的原因基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似返回11.2.3分子结构与荧光的关系1.分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构：结构中有共轭π→π*产生的K带，能吸收紫外-可见光（2）具有一定的荧光效率（）：荧光效率（）：吸收的光量子数发射的光量子数荧光效率只能为0～1荧光效率低的物质可能有强的紫外吸收，但所吸收的能量以无辐射跃迁的方式释放，不出现荧光发射；2.分子结构对荧光的关系（1）跃迁类型：→*是强吸收带，电子跃迁几率大，荧光效率高；n→*是弱吸收带，电子跃迁几率小，产生的荧光极弱；（2）共轭效应：提高→*共轭度，有利于增加荧光效率，并产生红移（3）刚性共平面结构：刚性共平面结构，电子共轭性增加，荧光强度增大。（4）取代基效应：芳环上有供电基，使荧光增强。①给电子基团引入，φ↑（-NH2，-OH，-OCH3等），增加共轭程度②吸电子基团引入，φ↓（-COOH，-NO2，-Cl等），减弱共轭程度③影响不大：-SO3H，-NH3+，-R，对共轭体系作用较小返回续前苯萘蒽λex=205nmλem=278nmΦf=0.11286nm321nm0.29356nm404nm0.36联苯φf=0.2芴φf=1.0返回1、温度：低温，φf↑。原因：温度T↑，分子运动加快，磁撞几率↑无辐射跃迁↑2、溶剂：①溶剂介电常数↑，极性↑，n→π*,ΔE↑,φf↓，λ↓π→π*ΔE↓,φf↑，λ↑②溶剂含重原子或溶解氧（CBr4等)，体系间跨越↑。使φf↓，甚至熄灭。③溶剂粘度σ↑，φf↑，F↑11.2.4影响荧光强度的外界因素续前3、pH影响对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制；4、荧光熄灭的影响荧光物质与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或熄灭的现象。引起荧光熄灭的物质为荧光熄灭剂常见的熄灭剂有：卤素离子、重金属离子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物。给电子基团续前5、散射光的干扰散射光:当一束平行光照射在液体样品上，大部分光线透过溶液，小部分光线由于光子和物质分子相碰撞，使光子的运动方向发生改变而向不同角度散射，这种光称为散射光。瑞利光:光子和物质发生弹性磁撞时，不发生能量交换，仅光子方向改变，这种散射光称为瑞利光。其波长与入射光相同。拉曼光:光子和物质发生非弹性磁撞，光子改变方向同时，与物质有能量交换，散射光波长有所改变，增大或减小，这种散射光为拉曼光。波长增大的拉曼光对荧光测定有干扰硫酸奎宁在不同激发波长下的荧光(a)与散射光谱(b)荧光光谱散射光谱瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm荧光448nm激发320nm激发350nm瑞利光350nm返回11.3荧光定量分析2、荧光强度与浓度关系：（稀溶液）荧光强度F与溶液吸收光能的程度以及溶液中荧光物质的量子效率有关。若荧光物质浓度很小，满足Ecl0.05时，荧光强度与荧光物质浓度成正比F=k(I0-I)=KC1、荧光测定方向：激发光源垂直方向，避免透射光干扰。受激后，可在各个方向发射荧光，在透过光的方向不易测定F。入射光透射光荧光I0IF入射光透射光荧光I0IF返回11.4荧光分析技术及应用1、荧光仪器简介：四个部分：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。（1）光电荧光计高压汞灯透镜样品池第一滤光片第二滤光片光电管电表光电荧光计光路图高压Hg灯，产生线光谱将不需要的光滤去低荧光的玻璃或石英制成，四面透光。只让荧光照射到检测器上续前（2）荧光分光光度计氙灯样品池检测器荧光分光光度计光路图•固定激发波长λex，扫描荧光光谱，找荧光光谱λmax。•固定荧光光谱λmax，扫描激发光谱，找激发光谱λmax。•固定激发光谱λmax。扫描荧光光谱，找荧光光谱λmax。续前（3）荧光光电计与荧光分光光度计的比较光电荧光计荧光分光光度计激发光源汞灯氙灯激发单色器第一滤光片光栅发射单色器第二滤光片光栅检测器光电倍增管样品池石英、玻璃池（低荧光的玻璃）返回小结：掌握•基本概念：荧光、振动弛豫、内部能量转换、外部能量转换、体系间跨越及磷光；激发光谱与荧光光谱•基本理论：溶液荧光光谱的特征；物质发射荧光的条件；荧光定量分析的依据、条件及方法•熟悉：影响荧光强度的因素（分子结构和外界条件）了解•荧光分析仪器练习：P297，思考题3、5，8