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第十三章复习题一、简述胚胎干细胞体外培养的关键技术1、胚胎干细胞来源（1）胚胎内细胞团（2）原始生殖细胞（3）胚胎瘤细胞2、胚胎干细胞的分离（1）免疫外科学法（2）组织培养法（3）显微外科学法3、培养方法（1）有滋养层培养法（2）无滋养层培养法4、胚胎干细胞的鉴定（1）碱性磷酸酶活性（2）端粒酶活性（3）干细胞标记物二、举例说明怎样分离鉴定成体干细胞骨髓造血干细胞分离1、造血干细胞分离:抽取的患者骨髓液500mL按4∶1比例加入HES,自然沉降红细胞后,分离上清。4℃,400g离心10min得细胞沉淀物,以1%白蛋白盐水液洗涤细胞2次。percoll液密度梯度离心法:按体积比为(115～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1500r/min,离心20min。取单个核细胞层,以1%白蛋白盐水液洗涤3次。2、造血干细胞冷冻保存:将二甲基亚砜(DMSO)、HES、血清白蛋白配成终浓度分别为5%、6%、4%的混合冷冻保护液。在0℃冰水浴中,将分离的干细胞缓慢加入冷冻保护液中,使细胞浓度为1×109/L。采用程序降温仪控制细胞温度的下降速率:5℃/min下降到4℃,维持8min;2℃/min下降到-30℃;1℃/min下降至-40℃;5℃/min下降至-80℃,维持5min;将干细胞放入液氮罐中冷冻保存1年。3、造血干细胞的复苏:细胞放入40℃水浴中,控制在1min内使其快速融化。4、有核细胞(NC)及单个核细胞(MNC)计数:采用血细胞计数池计NC及MNC总数。5、锥虫蓝活率测定:用014%锥虫蓝1滴加入9滴细胞悬液浸染细胞3min。被染成淡蓝色为死细胞,而活细胞拒染。用血细胞计数池计数未染色的细胞。根据下列公式计算细胞活率:活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞数+死细胞总数)×100%。6、粒2巨噬细胞集落生成单位(GFU2GM)培养:采用甲·994·山西医药杂志2007年6月第36卷第6期ShanxiMedJ,June2007,Vol36,No.6基纤维半固体培养基体系进行集落培养。培养体系中含有50μg/L重组干细胞生长因子(rhSCF)、10μg/LrhGM2CSF、10μg/L重组白细胞介素(rhIL)23。在1mL培养体系中加入1×105个有核细胞。5%CO2,37℃条件下培养14d,倒置显微镜下计数CFU2GM。7、CD34+细胞检测:取100μL细胞液体,加入50μL异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗CD34+抗体。阴性对照加入50μLIgG2藻红蛋白(PE)。室温避光放15min,加溶血素500μL,避光30min后流式分析。三、分析讨论干细胞研究的优点与存在的问题胚胎干细胞1.胚胎干细胞优点：无限的分化潜能。2.胚胎干细胞问题（1）来源限制：人类胚胎干细胞研究存在细胞来源限制问题。（2）体外培养困难：由于胚胎干细胞在体外培养会自发分化，而且机制还不非常清楚，控制胚胎干细胞分化的抑制的技术有待完善，例如饲养层细胞与条件培养基还不成熟。（3）安全性：胚胎干细胞和多能成体干细胞的自发分化方向是多向的，移植到体内的干细胞的分化方向会与预期不同。干细胞移植后的成瘤性风险也比较大。异体移植仍能引起免疫排斥反应。（4）伦理道德问题：获取人的胚胎干细胞、建立胚胎干细胞系必须要破坏胚囊，体外培养的胚囊是否具有生命还存在着争议，所以人类胚胎干细胞研究面临伦理道德问题。成体干细胞1.成体干细胞优点（1）来源方便：可以从自身获得。（2）没有伦理学问题：成体干细胞来自成熟个体，不会损伤供体。（3）避免免疫排斥反应：同种异体胚胎干细胞及其分化细胞用于临床会引起免疫排斥。尽管通过采取自身供体细胞核通过治疗性克隆可以得到自身胚胎干细胞，但是克隆技术的不成熟限制了目前的应用。（4）比较安全：虽然胚胎干细胞能分化成各种细胞类型，但目前还不能完全控制胚胎干细胞的定向分化，容易导致畸胎瘤。相对而言，成体干细胞比较安全。成体干细胞问题（1）由于成体干细胞在组织中含量极少，又缺乏特异性检测标志，因此很难从组织中分离纯化出来。（2）成体干细胞的可塑性机制还不清楚。例如：脂肪组织来源的干细胞不能排除随血液进入脂肪组织的造血干细胞或其他类型的干细胞。要确定一种成体干细胞的确切的组织来源还需要进行大量深入的研究。（3）还有待建立有效的使成体干细胞在体外增殖而又能维持未分化状态的技术。（4）成体干细胞体外长期传代后会发生表型的改变，且成体干细胞也参与肿瘤的形成。因此，有关成体干细胞的生物学安全性也越来越受到人们的关注。