醋酸纤维薄膜电泳实验

醋酸纤维薄膜电泳实验实验目的1.了解电泳仪的结构及工作原理2.初步掌握电泳仪的基本操作。3.了解常用的蛋白质显色方法。实验器材醋酸纤维薄膜，pH8.6巴比妥缓冲液：称取巴比妥钠10.30g，巴比妥1.84g，溶于1000ml蒸馏水中，或者称取10.3g巴比妥钠，加1mol/L盐酸8ml，加蒸馏水至1000ml。染色液：氨基黑10B1g溶于10ml冰醋酸与90ml甲醇的混合液中。洗涤液：冰醋酸10ml加甲醇90ml,或者甲醇50ml，冰醋酸10ml加蒸馏水40ml.透明液：甘油溶液，或用苯甲醇，水杨酸甲醇等溶液。微量注射器，蛋白质样品液和电泳仪一台。实验原理以醇酸纤维等制成薄膜作为支持体的电泳仪称为薄膜电泳。在一定酸碱度条件下，蛋白质分子由于基团电离而带有一定的电荷，在含有缓冲液的薄膜上，受电场力作用以一定的速度向一定的方向移动。不同的蛋白质分子，由于所带电荷的不同，移动的速度和方向也不同，从而达到分离。这种薄膜对蛋白质样品的吸附作用小，几乎完全消除纸蛋白质电泳中出现的拖尾现象，又因为薄膜的亲属性比较小，它所容纳的缓冲液也少。电泳是的电流大部分是样品在传导，因此具有简单，快速，区带清晰，灵敏度高，易于定量和便于保存的特点。本方法样品用量少，5ug的蛋白质就能得到满意的结果。因此特别适合于病理情况下微量蛋白检测。以广泛用于蛋白质和同工酶的分离分析，也可以用于免疫电泳等方面。实验步骤1醋酸纤维薄膜的准备将醋酸纤维薄膜切成10cm*2.5cm的膜条，用镊子夹住缓慢放入巴比妥缓冲液中30分钟，充分浸透，取出用滤纸吸去多余的缓冲液。2点样用微量吸管将5ug但白字样品点在薄膜中英。3电泳仪湿润的薄膜条置于电泳仪的长条架子上，薄膜条两端与滤纸相接触，拉直膜条，将滤纸条的另一端浸入缓冲液中，缓冲液两槽的液面要水平，以避免虹吸现象。加盖密封，注意防止缓冲液蒸发并避免水滴落在膜条上。静止10分钟。接通电源开始电泳，调节好电压使之稳定，以20mv/cm的电场强度电泳1小时左右。4.显色电泳完毕后，取出膜条，用溴酚蓝显色法或者氨黑10B显色法处理，取出膜条后浸入氨基黑染液中染色5~10分钟，然后用漂洗液洗5分钟，直到区带清晰为止。若要保存图谱或使用分光光度计直接测定，则可在膜条染色后，洗褪底色，完全干燥后，置于透明液中5分钟，取出，干后即可。思考题1醋酸纤维薄膜的特点及使用场合。2简述醋酸纤维薄膜电泳原理。3电泳操作时应该注意哪些问题？注意事项1、醋酸纤维素薄膜的预处理市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s—30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。2、缓冲液的选择醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8cm—10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。3、加样量加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1μl，相当于60μg—80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。4、电量的选择电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。5、染色液的选择对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。6、透明及保存透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易平展。