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橙皮中黄酮类化合物的提取研究指导教师：孙卫青答辩人：徐江岩目录材料与方法2前言31结论34致谢35结果与分析33前言•1结构与性质简介•2生物活性•3提取和测定方法的研究现状•4研究现状及发展趋势•5研究的目的和意义结构与性质简介•黄酮类化合物是植物光合作用产生的一类重要的天然有机化合物，泛指由两个苯环(A环和B环)通过三个碳链相互连接而成的一系列化合物(C6-C3-C6)。根据中央三碳的氧化程度，B环连接位置，以及三碳链是否构成环状等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类，分别是黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、二氢黄酮醇类,大多以糖苷的形式存在。生物活性•黄酮类化合物广泛存在于牧草、水果、蔬菜和药用植物中,植物长期自又选择过程中产生的一些次级代谢产物。迄今为止,在植物中已发现近10000种结构独特的黄酮类化合物。黄酮类化合物不仅结构样多,且不同类型的还表现出了不同的生物功能和活性。主要有抗氧化自由基作用、抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒活性、护肝活性、黄酮类化合物和维生素C在生物学系统中存在着相互作用的关系、雌激素作用、抗癌活性。研究现状及发展趋势•国内多数研究人员停留在对黄酮类化合物、类柠檬苦素粗制品的研究上,多数公司经营HLPC纯度的黄酮类化合物或它们的改性物多是国外产品。对癌细胞有很好抵抗作用的多甲氧基黄酮,价格昂贵,国内还没有纯度达标产品。从橙皮中提取的辛弗林、橙皮昔已经作为药物应用于临床；黄酮类化合物可以改善饮料的品味,橙皮普氢化后产物的甜度是蔗糖1500倍；类似于银杏黄酮、大豆黄酮的保健品也已经在国内外市场上上市。欧美、日本、等国家或地区把黄酮类化合物、类柠檬苦素在清除人体内有害自由基、杀死癌细胞的药用研究看作医学界一个热点,我国的很多大学、医院、研究所的科学工作者也己尝试这方面研究。研究的目的和意义•黄铜类化合物是一种天然的抗氧化剂，具有很高的药用价值，如抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、消炎镇痛、免疫调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用。黄酮类化合物还在食品、化妆品、药品等行业中广泛应用。材料与方法•（1）试验材料及药品及仪器•实验材料：橙子皮•药品：饱和石灰水，盐酸，氢氧化钠，石油醚(30-60)，乙醚，乙醇，正丁醇，大孔树脂。•（2）试验方法•试验选定浸泡时间、pH值、固液质量体积比、超声时间四个因素来研究黄酮类化合物的溶解性。在每组试验中，用电子天平称量5份原料粉末于150ml广口玻璃瓶中，每份2.00g。然后加入饱和的石灰水调节pH值的一定体积、一定浓度的水溶液，静态浸泡，超声一段时间后，过滤。然后在4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2mL提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。材料与方法•（3）黄酮含量的测定方法•取芦丁标准液（0.115mg.ml）精确吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4ml置于25ml试管中,加5%亚硝酸钠0.3ml，放置6min,再加入10%硝酸铝0.3mL,放置6min,加入4%氢氧化钠4.0ml，加水至10ml刻度,摇匀。510nm处测定吸光值。•以吸光值（A）为纵坐标y，芦丁质量浓度为横坐标x，绘制标准曲线(见图1)。得到芦丁质量浓度x与吸光度y关系曲线的回归方程为：•y=8.3437x+0.0033，R=0.9932.材料与方法•提取液中总黄酮的含量测定：称取脱脂柑橘皮粉2.00g，提取完毕后，容量瓶定容至100ml，取2ml提取液测其吸光度，测定方法同上。•根据公式（1）计算由标准曲线换得的总黄酮的浓度，计算公式：•C=y-0.0033÷8.3437（2）•y—单因素试验或正交试验中测得的吸光度（A）•根据公式（2）计算提取液中总黄酮提取率，计算公式：•W（%）=c÷2.00（3）•W—柑橘皮总黄酮提取率（%）•C—由标准曲线换算得的总黄酮浓度（mg/ml）结果与分析•单因素实验•称取相同质量的橙皮粉末5份各2.00g，设定提取液体积50ml，pH值11.0，超声时间15min，浸泡时间分别为1h，3h，6h，9h,12h。然后再4000rpm下离心20min，大孔树脂吸附，分别取上清液于100ml容量瓶中，定容，取2ml提取液经NaNO-Al(NO)3显色后，在波长510nm下测吸光度。结果与分析•浸泡时间对黄酮提取液吸光度的影响结果与分析•提取液pH值对黄酮提取液吸光度的影响结果与分析•提取液体积对黄酮提取液吸光度的影响结果与分析•超声时间对黄酮提取液吸光度的影响结果与分析•正交试验•它根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行实验，这些点具备了齐整可比,均匀分散的特点。正交试验设计是试验优化的常用方法。所谓试验优化，是指在最优化思想的指导下，进行最优设计的一种优化方法。它从不同的优良性出发，合理设计试验方案，有效控制试验干扰，科学处理试验数据，全面进行优化分析，直接实现优化目标，已成为现代优化技术的一个重要方面。本文采用3水平的L9(34）四因素三水平的正交试验确定最佳提取工艺。结果与分析•黄酮提取工艺中的影响因素和水平结果与分析•正交试验表结果与分析•提取液pH对黄酮的提取影响最大，其次是固液质量比、浸泡时间，影响最小的是超声处理时间。既影响提取的主次因素为BCAD。最佳因素水平为A1B3C2D2,即最佳提取工艺为浸泡时间8h、提取液pH12、体积45ml、超声处理时间15min。讨论与结论•本研究以澄清石灰水为溶剂从橙皮中提取黄酮类化合物，以浸泡时间、提取液pH、固液质量比、超声处理时间为影响因素，单因素实验中各个因素的最优条件范围分别为22.5倍原料干重提取液，pH为11.0左右的石灰水，常温侵泡9h后，超声处理15min。在正交试验中优组合为，浸泡时间8h、提取液pH为11.0、提取液体积45ml、超声处理时间15min。黄酮的提取工艺影响程度为提取液pH固液质量比浸泡时间超声处理时间。优组合时，黄酮提取率最高，为3.586%。致谢•在本试验的设计、操作和论文的撰写过程中，得到了长江大学生命科学学院孙卫青老师的悉心指导。自选题以来，孙卫青老师给予我了很多宝贵的意见。在论文的选题、实施和成文的整个阶段，孙老师在百忙之中给予了精心的指导。孙老师为人随和热情，治学严谨细心的态度让我受益匪浅，对我今后的成长具有深远的影响。在此谨向孙老师致以最诚挚的谢意！