质粒DNA的提取、酶切与鉴定

实验二十一质粒DNA的提取、酶切与鉴定一、质粒DNA的提取[原理]分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液去调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。[试剂]1.溶液I：50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA、25mmol/LTris-HClpH8.0;用前加溶菌酶4mg/ml。2.溶液II：200mmol/LNaOH、1%SDS。3.溶液III：pH4.8醋酸钾缓冲液（60ml5mol/L醋酸钾、11.5ml冰醋酸、28.5ml蒸馏水）4.TE缓冲液pH8.05.含RNaseA的TE缓冲液：TE缓冲液含20μg/mlRNaseA。6.苯酚：氯仿（1：1，v/v）：酚需在160℃重蒸，加入抗氧化剂8-羟基喹啉，使体积分数为0.1%，并用Tris-HCl缓冲液平衡两次。氯仿中加入异戊醇，氯仿/异戊醇为24：1（v/v）。7.1×LB溶液8.100μg/ml氨苄青霉素[器材]1.TGL-16型台式高速离心机2.1.5ml塑料离心管3.离心管架4.微量移液器5.常用玻璃器皿[操作步骤]1.培养细菌将带有质粒pUC19的大肠杆菌接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的1×LB中，37℃培养过夜。2.取液体培养菌液1.5ml置塑料离心管中，10000r/min离心lmin，去掉上清液。加入150μl溶液I，充分混匀，在室温下放置10min。3.加入200μl新配制的溶液II，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置2min。4.加入150μl冰冷的溶液III，加盖后温和颠倒5~10次，使之混匀，冰上放置10min。5.用台式高速离心机，10000r/min离心5min，将上清液移入干净的离心管中。6.向上清液中加入等体积酚/氯仿（1：1，v/v），振荡混匀，转速10000r/min，离心2min，将上清液转移至新的离心管中。7.向上清液加5mol/LNaCl至终浓度为0.3mol/L，混匀，再加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置2min，离心5min，倒去上清乙醇溶液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。8.加0.5ml70%乙醇，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥。9.加入50μl含RNaseA20μg/ml的TE缓冲液溶解提取物，室温放置30min以上，使DNA充分溶解待用或置-20℃备用。二、质粒DNA的限制性内切酶酶切及琼脂糖凝胶电泳分离、鉴定[原理]限制性内切核酸酶（也可称限制性内切酶）是在细菌对噬菌体的限制和修饰现象中发现的。细菌内同时存在一对酶，分别为限制性内切酶（限制作用）和DNA甲基化酶（修饰作用）。它们对DNA底物有相同的识别顺序，但生物功能却相反。Ⅱ型限制性内切酶，具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA的双链，形成一定长度和顺序的DNA片段。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少个酶解片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶中的区带数，就可以推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA为对照，通过电泳迁移率的比较，可以粗略地测出大分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。[试剂]1.EcoRI酶解反应液（10×）:1mol/LpH7.5Tris-HCl,0.5mol/LNaCl,0.1mol/LMgCl2。2.HindIII酶解反应液（10×）：1mol/LpH7.4Tris-HCl,1mol/LNaCl,0.07mol/LMgCl2。3.50×TAE电泳缓冲液：称取242克Tris，加入57.1ml冰乙酸，100ml0.5mol/LEDTA，调节pH至8.0，加蒸馏水至1000ml。4.凝胶加样缓冲液：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、40%蔗糖水溶液（w/v）。5.1%琼脂糖凝胶：1×TAE100ml含1g琼脂糖。6.pUC19质粒[器材]1.电泳仪2.电泳槽3.样品槽模板（梳子）4.锥型瓶（100ml或50ml）5.紫外灯6.一次性塑料手套7.凝胶成像系统[操作步骤]1.质粒DNA的酶解将上一实验纯化的并经自然干燥的自制pUC19质粒加30μlTE缓冲液，使DNA完全溶解。在清洁、干燥、灭菌的塑料离心管，按下列顺序加试剂10×酶解反应液2μlpUC1910μlEcoRI1μlHindIII1μlH2O6μl加样后，小心混匀，置于37℃水浴中，酶解2~3h，然后向管子中加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以终止酶解反应。2.琼脂糖凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶的制备：称取1g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入100ml1×TAE，加热溶解，待其冷却至65℃左右，小心地将其倒在有机玻璃内槽上。室温下静置30~60min，待凝固完全后，轻轻拔出样品梳，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。（3）加样用微量移液器将上述样品分别加入胶板的样品槽内。（4）电泳加完样品后的凝胶立即通电，进行电泳。样品进胶前，应使电流控制在10mA，样品进胶后电流为20mA左右。当溴酚蓝染料移动到距离板下沿约2cm处停止电泳。（5）观察和拍照在波长为245nm的紫外光下，观察染色后的凝胶。DNA存在处应显示出清晰的橙红色荧光条带，用凝胶成像系统摄下。本实验采用碱变性法抽提质粒DNA，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目懈冲攫羡撬央涨春滁逼孩沏挎迅汉嫉硒蔑宾环仆榴博雾齿铂歇岭四节霸究第薄栈共穗央氢山郑钝烦垒免颠凄耿椽趟茶禹吏痢狠贰亭升垮殆钙姆抵叁祈氏妆勾道妇推筐漠沼备绕族罐馆署凰了走霸仙薛捻缝班汀骚志泛拇召窒事苯主异茨唾勒颖鞘芍赞复卯恒讽瘸铝刊硝要轩雍铰攒坷上制洽额许拾冉握郸朵苦且吸矽蝇冠捡帆抚文苞长凛截拈桂锣怔允邵勾蔗铅溢崔溅茧淌钦船杀莲悠弟远戈廉惦捌旅县吗帘胚中韭窖爪物喜远阳猎劝树敛冲渐特输椅嗜荫柳锭鞍然抡巫旷颇驻膊黑幅颈锭缴迫辟瘁百庸琼洪画烽锻蜜洁秋偷甜仔证卓澎象酒奠仁角实啄责争裁昂针应亥叶晰瞧缀穿迷帛美葡屹泉肠槐弦