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简述基因的克隆和表达的步骤1）获得目的基因和质粒载体；2）形成重组质粒；3）制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；4）培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；5）筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定；6）表达目的蛋白。实验一：质粒DNA的提取及鉴定1.分子生物学实验常用载体有哪些?它们的特点是什么?常用载体：大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒、酵母人工染色体载体、动植物病毒载体。特点：具有复制子（一段具特殊结构的DNA序列，使与之结合的外源基因复制）、可检测的遗传表型、限制性内切酶单一识别位点（便于外源基因插入）、适合的拷贝数（有利于载体制备；使细胞中克隆基因的剂量增加）2.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些异同点？相同：提取的步骤基本上都属DNA的提取步骤，包括细胞裂解，DNA释放，纯化，最后沉淀溶解。不同：质粒提取过程中，有一个DNA变性、复性的过程，这个与基因组提取完全不同，这是利用质粒是以超螺旋结构存在于大肠杆菌中的特殊状态，分离纯化质粒时总是会利用这个特点来分离基因组DNA与质粒DNA。3.核酸分离过程中，酚、氯仿、异戊醇的作用是什么？1）酚、氯仿作用是变性蛋白质。酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。2）异戊醇是消泡剂。在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。4.在TE缓冲液中为什么要加入EDTA？EDTA是为了螯合Mg2+、Ca2+等金属离子，抑制Dnase5.纯化的核酸如有酚和蛋白质的污染，对它的后期操作有何影响？DNA制品中的蛋白质、酚污染会降低内切酶的活性，影响酶切效果。（好像还有什么的，想不起来了）6.有哪些因素影响核酸的沉淀？7.提质粒时，溶液2为什么现配现用？溶液2中的主要成分是NaOH和SDS。NaOH是裂解细胞膜的主要成分，长时间与空气接触会吸收二氧化碳，导致碱性下降，不利于破碎细胞，影响质粒的产量。8.加入溶液3后产生的白色沉淀成分是什么？钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS。SDS专门和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。9.为什么用TE缓冲液悬浮和保存质粒更好？TE是Tris-HCl和EDTA的简称。在后续对质粒的操作中,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,其他缓冲液系统（如磷酸盐缓冲系统（pKa=7.2）和硼酸系统(pKa=9.24)等）虽然也都符合细胞内环境的生理范围,可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3(PO4)2沉淀。而Tris-HCL(pKa=8.0)缓冲系统使用缓冲对是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCL系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。不存在金属离子，不产生干扰作用10.碱裂解法的原理和步骤（步骤见ppt）原理：根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。11.酚抽提的酚的两个作用使蛋白质变性沉降、抑制DNase活性实验二、质粒DNA的酶切鉴定及电泳检测1.对核酸进行限制性酶切时应注意什么？保证样品纯度（DNA制品中的污染蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS等会影响内切酶活性）对于酶切条件的控制（合适的酶反应体积、酶作用单位、反应时间）2.如何提高核酸电泳的分辨率？主要的是加大琼脂糖凝胶的密度，还可以降低跑电泳的电压，增大跑电泳的时间等.实验三、DNA片段的回收及连接反应1.单酶切重组DNA有哪些弊端，如何避免？弊端:末端相同，可能发生自连，产生大量无效连接产物；插入片段没有方向性避免方法：使用双酶切；若用单酶切，可以将载体5’末端去磷酸化，并提高插入片段与载体的浓度比。2.在不计算DNA片段浓度的情况下，如何快速简便的估算连接片段的比例？3.DNA连接反应的原理步骤、两种常用的筛选方法（见ppt）4.质粒重组的影响因素？反应温度；连接酶的用量；DNA末端的性质；DNA浓度及两种DNA分子数的比例5.连接时目的基因和载体的最佳摩尔比最佳比例是由构造及末端的类型决定的，一般需要较高的插入片段与载体的摩尔比例，如2：1甚至5：1。6.DNA回收照胶紫外线使用短波还是长波？应使用长波紫外灯。因为短波紫外线（254nm）会引起DNA链断裂，或是造成基因突变。7.DNA连接反应的原理步骤8.乙醇中为什么不加盐？参考答案：洗的时候不加盐是为了除盐，做乙醇沉淀时加盐是因为单价阳离子有利于聚沉DNA9．DNA连接酶两个主要特点是什么；催化DNA5’磷酸基与3’羟基之间（切口）形成磷酸二酯键；DNA连接酶只能作用于双链DNA分子而不能将二个单链DNA分子连接（这个算不算？）。10．连接反应体系的加样顺序是什么ddH2O,10×T4缓冲液,DNA片段,最后加T4DNA连接酶11.在设计酶切和连接的时候，应该特别注意什么？阅读框的保证实验四、感受态细胞的制备与重组DNA的转化1.如阴性对照中长出菌，可能原因是什么？污染……2.菌的密度过高或培养时间过长时，会在阳性菌的周围长出一些小的卫星菌落，它们是非Kan抗性的，试分析原因。阳性菌能编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力。培养时间过长，β-内酰胺酶使周围抗生素的降解，使得不带抗性的菌也能生长，形成卫星菌落。3.制作感受态细胞中最关键的操作？4.重组子两种常用的筛选方法抗生素筛选法：菌株为某种抗性缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素（Ampr）抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力。）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。互补法：又称蓝白斑筛选法，质粒上LacZ′基因编码的α肽链与受体菌中编码的β半乳糖苷酶C端突变体互补，形成有功能的β半乳糖苷酶，在特定培养基上显蓝斑，这种现象称为α互补。如果有外源DNA片段插入质粒上的LacZ′基因中，则β半乳糖苷酶失活，显白斑。6.影响转化效率的因素细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态（OD值：0.3－0.5(5X107个/ml)）；试剂的质量；化合物及无机离子（Rb+、Mn+、二甲亚砜等）；质粒：大小、构型；外源DNA（质粒）与细胞的比例；器皿的洁净度；污染（尽量所有打开器皿盖的操作都在超净台中进行）7.转化效率计算转化效率(每微克质粒DNA的转化子数)＝转化子总数(个转化子)/加入质粒DNA的量(μg)转化子总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）8.简述蓝白斑检测原理质粒上LacZ′基因编码的α肽链与受体菌中编码的β半乳糖苷酶C端突变体互补，形成有功能的β半乳糖苷酶，在特定培养基上显蓝斑，这种现象称为α互补。如果有外源DNA片段插入质粒上的LacZ′基因中，则β半乳糖苷酶失活，显白斑。实验五、重组克隆的鉴定（菌落PCR检测），接种培养1.PCR变性，退火，延伸温度（95℃预变性5min）94℃变性45sec50℃退火45sec72℃延伸45sec2．怎么计算PCR退火温度Tm-53.PCR中如果出现非特异的条带，可能是哪些方面出现问题，应该如何调整？4.减少错掺的对策：加入Taq酶后迅速反应，避免低温下进行的链延伸；酶浓度不可过大；dNTP不可过浓；Mg2+浓度适中实验六、重组克隆子的酶切鉴定1.比较菌落PCR和提质粒酶切这两种方法的优缺点，为什么需要两次鉴定？菌落PCR快，灵敏，但是易出现假阳性，一般做初筛；提质粒酶切结果可靠，但是耗时比较长，一般做最终确定。实验七、大肠杆菌BL21感受态细胞制备及重组DNA的转化1.简述BL21感受态制备和转化的步骤实验八、蛋白质的诱导表达1.BL21和DH5a的比较1）DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。E.coliDH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。DH5α质粒拷贝数高,用于质粒克隆、重组筛选、适合保存菌种,也可以表达某些蛋白2）BL21(DE3)菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。2.IPTG的作用原理（ppt）3.如何通过调节IPTG的浓度和温度来控制蛋白表达速度，从而提高蛋白的可溶性？4.在诱导表达时，对蛋白质表达的影响因素？5.原核表达系统的特点其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。•细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子•真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译•缺乏转录后加工系统，不能切除内含子,cDNA,•表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏•缺乏翻译后加工体系•可能形成不溶性的包涵体6.诱导表达蛋白为什么要使用T4噬菌体的启动子而不用大肠杆菌自己的启动子？实验九、蛋白质的纯化1.在蛋白纯化过程中，lysisbuffer，washbuffer和Elutionbuffer中所含有的咪唑的作用是什么？lysisbuffer，washbuffer中低浓度咪唑封闭多于结合位点，防止杂蛋白与镍离子结合。Elutionbuffer中高浓度咪唑与目的蛋白竞争镍离子，将目的蛋白洗脱下来。实验十、诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳检测1.蛋白电泳上样缓冲液的作用及煮沸的作用蛋白电泳上样缓冲液包括2%SDS,0.1%溴酚蓝10%甘油,SDS是保证样品中的所有蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响。还原剂是让二硫键处于断开状态，保证蛋白分子的线性.溴酚蓝作用是指示上样蛋白的跑胶时标记的，甘油是增加上样重量的，以免漂浮，煮沸是使蛋白变性的永久保存。2.SDS-PAGE的应用有哪些？1）蛋白质纯度分析；2）蛋白质分析量的测定，根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量；3）蛋白质浓度的测定；4）蛋白质水解的分析；5）免疫沉淀蛋白的鉴定；6）免疫印迹的第一步；7）蛋白质修饰的鉴定；8）分离和浓缩用于产生抗体的抗原；9）分离放射性标记的蛋白质；10）显示小分子多肽。3.SDS-PAGE电泳的原理和步骤（详见ppt）（我就考到了这一题，原理我才提到三