cDNA文库的构建

cDNA文库的构建主讲人：刘圆圆制作者：王卓答疑：栗建辉主要内容：1.cDNA文库构建的定义2.cDNA文库构建原理3.cDNA文库构建的过程cDNA文库构建的定义：•定义：•(cDNALibrary)某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。•cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。cDNA文库构建原理：•经典cDNA文库构建的基本原理：用Oligo（dT）作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得cDNA文库。其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。cDNA文库构建的过程步骤：A.RNA的提取与分离B.第一链cDNA的合成C.第二链cDNA的合成D.双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖RNA的分离：•1、取大约1cm2植物叶片，在研钵中充分研磨后转移到1.5ml离心管。加入大约1mlTotalRNAExtrzctor。•2、将裂解后样品和匀浆液室温放置5-10min。使得核蛋白与核酸完全分离。(样品中如含有较多的蛋白质、多糖、脂肪或其他细胞外基质，可以12000rpm离心10分钟，移去漂浮的油脂，取上清。)•3、加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15sec，室温放置3min。12000rmp4℃离心10min。•4、吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，市室温放置20min。•5、12000rpm4℃离心10min，弃上清。(离心前RNA沉淀通常是不可见的，离心后在管侧和管低形成胶状沉淀。)•6、加入1mL75%乙醇洗涤沉淀。12000rpm4℃离心3min，弃上清室温干燥5-10min。(用1mL75%乙醇洗涤沉淀；不要倒出沉淀，剩余少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。)•7、加入20μlRNase-freeddH2O，充分溶解RNA，将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或用于后续实验。•（二）琼脂糖凝胶电泳检测DNA•1、配制0.1的琼脂糖凝胶，取50ml0.5*TBE加入0.5g琼脂糖。加热溶解后，再加入5μl4sGreen。•2、点样时，样品和6*loadingbuffer按照1:5的比例，混合均匀后点样。•3、点样完成后，80V恒压电泳40min左右。第一链cDNA的合成：•以RNA为模板在反转录酶作用下生成第一条链•第一链的合成•oligo(dT)引导的DNA合成法:•利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.缺陷:•因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.•随机引物引导的cDNA合成法(randomlyprimedcDNAsynthesis):•根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.第二链cDNA的合成：第二链的合成第一链的合成反应完成后，得到DNA/RNA杂交分子，在DNA聚合酶的作用下，以第一链为模版，合成cDNA的第二链。自身引导变性降解除去杂交分子中的RNA,单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶IKlenow或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.自身引导法合成双链cDNA缺点:•在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA5'端的地方的序列出现缺失和重排.S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.琼脂糖凝胶电泳检测DNA•目的：检测提取DNA的准确性。过程:胶板的制备•1、将有机玻璃内槽、梳子和水平制胶器洗净、晾干。晾干后将其组装，放置于稳定平面上。•2、在锥瓶的瓶口用玻璃纸封口，留有一定空隙。然后在微波炉中加热溶解琼脂糖。加热时，当溶液沸腾后，请戴上防热手套，小心摇动锥瓶，使琼脂糖充分均匀溶解。•3、使溶液冷却至50℃-60℃左右，在此时按照1μL/10mL的比例加入4Sgreen染料，并充分混匀。•4、将琼脂糖溶液倒入制胶模中，凝胶厚度一般在3~5mm之间。注意不要形成气泡。制胶模如下图所示，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。•5、在室温下使胶凝固，大约30分钟~1小时。点样•1、取适量样品与6×上样缓冲液混匀（如：1μl样品与5μl6×上样缓冲液），用微量移液枪小心加入样品槽中。•2、上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40μl为上限，大孔200μl为上限，具体和制胶膜规格相关）。•3、每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。•三、电泳•1、加完样后，合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在110V，电流在40mA左右。•2、当条带移动到胶板2/3时（约40min），停止电泳。•3、紫外下拍照并观察。PCR基因扩增•目的：增加目的DNA的数量过程：•1、将PCR使用的药品、试剂从冰箱取出，冰浴放置。按照PCR反应体系加药品，加药完毕后，用微型离心机离心数秒，使所加药品混匀。•2、PCR反应体系•在0.2mlPCR管内配制25ml反应体系•3、PCR反应程序：•预变性•变性•退火•延伸•再延伸•4、加药完成后，微型离心机离心10s左右。放置于PCR反应孔中，设置程序后开始反应。•5、琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果•(1)PCR反应完成后，配制50ml1％的琼脂糖凝胶。•(2)取1微升反应完成的样品+5微升6*loading-buffer混合均匀后点样。•(3)利用琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。•(4)PCR反应完成后的样品4℃下短时间保存。-20℃下可以保存数周。双链cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖•将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上,转化大肠杆菌寄主细胞增殖.•1,同聚物加尾法•利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端都加上一个互补的同聚片段,通过退火使两个连接片段成重组质粒,再将重组质粒转化受体细胞.•同聚物加尾法克隆双链cDNA•2,接头-衔接头法•3,mRNA-cDNA克隆法方法:•在mRNA反转录合成cDNA第一链后,将dA残基加到mRNA:cDNA杂交体上,然后与带dT尾的克隆载体连接,转化受体细胞,在宿主细胞内,mRNA被降解并代之以DNA.缺点:•克隆的效率低(为双链cDNA克隆的1/10)•4,Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNA蓝白斑筛选：•找出需构建的目的文库