实验室中文版原位杂交

Insituhybridizationfinaledition第一部分：1固定（第一天，下午）1)用DEPC水配制8%多聚甲醛（粉末）（作为储备液，4C可保存1月）：2)多聚甲醛（粉末）8g，溶解于100mlDEPC水中，60C孵育30min（此时多聚甲醛不溶）；加入10NNaOH15ul，调节pH值于7.4左右，用手振荡，多聚甲醛将快速溶解；3)用8%多聚甲醛储备液和PBS缓冲液配制4%多聚甲醛：8%多聚甲醛储备液50ml、10×PBS（DEPC配制）10ml、DEPC水40ml（4%的多聚甲醛作为工作液在1周内使用）；4)将组织块放置于10×体积的4%多聚甲醛溶液中固定1-2h（室温），其间缓慢摇动，4C放置过夜（16h，其间缓慢摇动）。注意：固定时，一定要保证多聚甲醛和材料中水分的充分交换，否则会造成材料不能很好固定！2脱水（第二天，早晨）：按下列顺序对材料进行脱水：1×PBS(DEPC)5min2次70%乙醇(DEPC)5min80%乙醇(DEPC)5min90%乙醇(DEPC)5min100%乙醇5min(脱水时间应随组织的体积大小适当变化)100%乙醇-30C过夜！注意：脱水时间的长度长一点不会对材料造成太大影响，但若脱水时间不够，用二甲苯透明的时候会让二甲苯浑浊，不能进行很好的置换，直接影响包埋效果！3包埋（包埋的时间依据材料的大小而定）：将材料转移到100%乙醇中，室温放置15min；再次在100%乙醇中放置10-15min；100%乙醇/二甲苯30min二甲苯浸泡30min×2次；注意：二甲苯浸泡时间不确定，依据为材料透明即可。如若透明时间过长，会使材料过脆，包埋好的材料在切片时会破碎！二甲苯/石蜡30min石蜡30min石蜡40min根据常规包埋方法进行包埋。注意：包埋过程中，二甲苯一定要脱干净，否则也会使材料变脆！因此在III蜡中放置的时间可以酌情延长，依据材料的体积而定。Note：组织过大，二甲苯未能使材料内的部分透明，切片时，此处材料会脱落，造成空洞。可否考虑100%乙醇/二甲苯浸泡时间稍微延长！？4组织切片：注意：切片材料为全鱼或者去除内脏的幼鱼片段时，骨骼（尤其是脊柱）会损伤切片刀片，造成切片脆裂或者切痕，在展片时，材料会破裂。因此，在切片时，一旦发现材料破碎或者出现刀痕，必须将切片刀片横移，避开刀片缺口！切片厚度应为5-8um；应同时准备一些该材料的组织切片用于HE染色；组织切片时为避免RNase污染，应保持使用无粉手套和DEPC水，切片完全干燥后应保存于4C。贴片，展片：所用已经coating的玻片一般只使用远离书写端1/3处。一来可以节约随后步骤中使用试剂的量；二来节约切片材料；三便于封片。展片时，先用滴管将DEPC水在靠近1/3处涂抹很薄一层液体，将弯钩解剖针挑取单张材料切片（尽可能切割整齐）放于液面（此时，材料将浮于液面，注意不要将切面朝上！），用滤纸将远端多余水分吸去一部分（以免过度展片），放置3-5行（视材料宽度而定），于39-42C的展片机上展片。Slidecleaning：5%Decon90清洗1h，自来水冲洗2h，蒸馏水冲洗数次并在200C干燥8h，并用手套将玻片放置于玻片盒中，保存于4C。Poly-L-Lysinecoating:用10mMTris-HCl缓冲液（pH8.0）配制50ug/ml多聚赖氨酸溶液，并向无RNase的玻片上滴加多聚赖氨酸溶液，37℃干燥24h。第二部分探针制备:1)将目的基因的cDNA或ORF插入到pGEM-TEasy载体（Promega，或者其他带有T7和SP6RNA聚合酶结合位点的载体），提取质粒DNA，并测序验证；2)测序验证后，挑选含所需插入方向的质粒，用T7和SP6结合位点外围的前后引物扩增包含T7和SP6结合位点和目的片段的线性DNA；3)PCR产物的纯化和定量；4)0.5-1ugPCR产物用于T7和SP6的体外转录（制备探针）：T7的转录效率比SP6高，一般用T7合成反义链，而SP6合成正义链探针；如果可能，直接将欲作为合成探针的模板克隆入pGEM-T载体中，然后通过PCR合成转录模板。克隆入普通亚克隆载体（如：pMD-19T）中，然后用T7-M13和SP6-M13-引物成模板后，转录的效果不是太好！0.5-1ugPCRproduct?l10XDIGRNAlabelingmix2l10XTranscriptionbuffer2lT7orSP6polymerase(20U/l)2l（共40U）RNaseinhibitor(40U/l)1l（共40U）DEPCDW?l总体积20l5)混合并离心;6)37C温育2-3h；7)加入DNaseI(RNasefree)(10U/ul)2ul，混合并离心；8)37C温育15min；9)加入50ul100%乙醇(2.5×体积),2ul(1/10体积)NaAC；10)涡旋混匀，在-20C放置2-6h或者过夜；11)4C，14000rpm离心30min；12)用70%DEPC乙醇洗一次；13)4C，14000rpm离心15min；14)移去乙醇并室温放置5min使乙醇挥发；15)加入50ulDEPC水和1ulRNase抑制剂；16)使用前测量RNA探针浓度（Sp6,~100ng/ul;T7,~400ng/ul）17)探针可在-80C保存1月化将目的片段/ORF插入到pMD-19T载体中，挑选一定插入方向的克隆，用T7-M13和SP6-M13-引物扩增目的片段，使其带上T7和SP6的启动子序列。电泳纯后，作为RNA探针合成的模板！一张用于原位杂交的切片一般需要加入200ul左右的探针！注意：这种方法合成出的模板，是否能很好合成RNA探针，还需要深入的证明！第三部分：insituhybridization第一天：杂交同时准备正义探针（T7）和反义探针（SP6）。1)复水二甲苯5min×3次（如近期再次实验，试剂可反复利用）100%乙醇1-5min×2次90%乙醇1min80%乙醇1min70%乙醇1min0.85XPBS-15min0.85XPBS-25min0.85XPBS-35min2)37C蛋白酶K4-10ug/ml(从20mg/ml储备液稀释)处理5-15min(成鱼卵巢，15min;幼鱼卵巢，10min；胚胎，稚鱼，精巢5min)(Tilapia幼鱼和成鱼用蛋白酶K（10ug/ml）处理5min即可——Kobayashi!)；3)0.85XPBS洗5min；4)4%多聚甲醛在室温中再次固定15min；5)2mg/ml甘氨酸(蛋白酶K的抑制剂？从甘氨酸储备液20mg/ml稀释)室温处理15min；6)0.1MTEA(三乙醇胺)(50%TEA2.65ml+2NHCL1.05ml+DEPC100ml)处理5min(dilutefromstockbeforeusing)室温；7)0.25%乙酸苷/0.1M三乙醇胺（用前向0.1MTEA中加入乙酸苷)10min，(100ml0.1MTEA+250ulaceticanhydride)室温；8)2XSSC5minRT9)预杂交：66%去离子甲酰胺/2XSSC，60C孵育1h（在染缸中进行）；本实验时原位杂交一般使用液体体积为70-80ml，高度以刚好淹没材料为准。50ml预杂交液:去离子甲酰胺:33ml20XSSC(DEPC)5mlDEPC水12ml10)60C-65C于杂交缓冲液中杂交14-16hr(湿盒中进行，可在其中加入预杂交液，以保证杂交过程中杂交体系不会干)。然后将湿盒封闭，避免在高温下，盒内湿度下降。一张用于原位杂交的切片一般需要加入200ul左右的探针！(Saveprobeforre-useiftheprobeisOK!!!!)Note：所有在高于室温下进行的湿盒中反应，均需将湿盒封闭！！！Hybridizationbuffer:Finalconcentrationtoprepare10mlFormamide60%6ml1.0MTris-HCL(pH:8.0)0.02M200ul0.5MEDTA(pH:8.0)0.0025M50ul100Xdenhardt’ssolution1X100ulNaCl（2.5M）0.3M1.2ml50%dextransulfate7.5%1.5mlDEPCtreatedDWX950ulKeepthehybridizationbufferat-20CPreparethehybridizationsolution:Probewithfinalconcentration200-500ng/mltRNA(20mg/ml)1ul/mlHybridizationbufferAccordingtothenumberofyourslidesWaterbathat80Cfor10mintodenatureRNAprobeLoadthehybridizationsolutionwithprobetoslides.第二天：Washandstaining(从这一步开始，溶液可以用蒸馏水进行配制，无需DEPC)Washing（rinse）：1)50%formamide/2XSSC55C~60C20min2)50%formamide/2XSSC55C~60C20min（用20XSSC配置，切勿用2XSSC直接配置！！！）3)2XSSC37C10min4)RNasetreatmentRNase/2XSSC100μg/ml(RNaseA的浓度应为10-100ug/ml)(RNase专用湿盒)5)2XSSC60C20min6)0.2XSSC60C20minNote:Pleaseincreasethetimeandtimesofwashingifthebackgroundisveryhigh.染色:1）DIG1洗涤室温5minDIG1bufferFinalconcentrationfor300mlMaleicacid0.1M3.48gNaCL0.15M2.63gpHto7.5AddD.W.to300mlAutoclave注意：根据罗氏说明书，未稀释抗体保存于4C，可放置至产品失效日期；稀释后的抗体，在4C仅能保存12h。切忌冻存！！2）DIG2封阻(DIG1中加入1%封阻剂（BSA）)30min室温(Chamber3)3）Anti-DIG-APisdilutedby500~10000timesinDIG2（最好依据产品说明书稀释2000-5000倍，即使抗体的量较少，也可通过延长显色时间进行调整）30min室温(Chamber3)(稀释后的抗体可重复使用!!!!!)4）DIG1洗涤15min×35）DIG3检测15minDIG3(缓冲液+底物)：Total30ml1MTris-HclpH9.53ml5MNacL0.6ml1MMgCL21.5mlDEPC24.9ml（呈色緩衝液（stainingbuffer）100mMTris,pH=9.550mMMgCl2100mMNaCl0.05%Tween20其餘補3次過濾水(3dH2O)。）ToavoidthediffusionofNBTandBCIP,add5-8%(w/v)vinylalcoholtoDIG3andheatto80-90degreeinwaterbathtocompletelydissolveit.CooldownandaddNBTandBCIP(AlwayskeepDIG3withvinylalcoholinroomtemperature.)NBT150μlBCIP112.6μl观察：DIG3染色30min后，镜检！如果信号足够强，用Tris-HCL-EDTA(pH8.0)终止染色；50%乙醇室温洗涤5min100%乙醇脱色1~2min50%乙醇室温再次洗涤5min将切片放入0.85XPBS镜检DW洗涤MounttheslideswithGlycergelMountingMedium(DakoCytomation).Otherwiseifthestaininga