人体肠道菌群定量技术研究进展

人体肠道菌群定量技术研究进展姜美娟，梁冰(中国人民解放军第401医院检验科，青岛266071)摘要在传统微生物学研究中，人们只重视致病菌的作用，而没有重视正常菌群的作用。通过对肠道菌群的分布特点和生理功能的了解，我们认识到肠道菌群的微生态平衡与人的健康及疾病的密切关系系，针对传统培养方法存在的问题，国内外专家先后开展了分子生物学方法的研究和生物学评价工作。本文结合本课题组的研究，对各种技术的特点及存在的不足进行了全面的论述。关键词肠道菌群;定量技术;进展中图分类号:R445.6文献标识码:Bdoi:10.3969/j.issn.2095－1434.2011.03.013正常菌群在人体内分布很广，其中以肠道菌群最具有代表性。对健康人的粪便标本研究已知，肠道内栖息着大约400～500种微生物，其中包括细菌、真菌和病毒等。这些微生物的总质量约为1kg，其体积相当于1个人的肝脏，其数量为1014个，是人体自身细胞总数的10～20倍［1］。在常见的十几种细菌中，绝大多数为专性厌氧菌，约占99%以上，包括双歧杆菌、乳杆菌、优杆菌、拟杆菌、消化链球菌等，也有少量的兼性厌氧菌、专性需氧菌和微需氧菌，如肠杆菌属细菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母样菌等。它们构成了人体胃肠道的生物学屏障。肠道正常菌群与宿主、菌群中各种微生物之间相互依存，相互协调，处于动态平衡。大量研究表明，肠道正常菌群对宿主具有消化、吸收、营养、生物拮抗等生理作用，实际上已成为宿主生命的必需的组成部分。当这些正常的微生物群落受宿主及外环境影响，其种群数和菌量、活性发生了异常或定位转移时，这些群落中就容易容纳外籍菌，原先的平衡遭到破坏，出现菌群失调。在人体抵抗力降低的情况下，如瘦弱婴幼儿，年老体弱和患急、慢性疾病者，以及长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、抗肿瘤药物和放射治疗者，尤其是应用广谱抗生素者，可使肠道正常菌群被抑制而数量减少，耐药的过路菌过量繁殖，造成肠道菌群失调，同时，肠道菌群的失调还会加重某些疾病的严重程度。因此确切了解肠道菌群变化及对肠道菌群进行精确定量对疾病的诊断有着重要的意义。1直接镜检法镜检法是目前广泛采用的进行肠道菌群分析的方法。该方法是通过油镜观察革兰染色粪便涂片的菌群象，估计细菌总数、球菌与杆菌比例，革兰阳性菌与革兰阴性菌的比例，结合各种细菌的形态特点、有无特殊形态细菌增多等结果来综合判断菌群状况。观察细菌总数可以先计数部分(如1/8视野)油镜视野中细菌的数量，再对整个视野进行估计，观察几个视野后取平均值。一般来说，每视野细菌数在501～5000个为正常，101～500个为轻微少，11～100个为明显减少，11个以下为显著减少，也有高于5000的情况，但较少见，临床意义不大。细菌总数减少则与肠道菌群失调存在密切关系，应引起重视，并结合细菌类别构成等指标进行综合评估。由于通过涂片镜检的方法无法精确区分细菌种类，一般就细菌形态和染色性将细菌分为4大类，即革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌，通过计算4者的比例来评估肠道菌群的特征。具体计数方法为:计数1000个细菌中各类细菌的百分率。可先计数部分视野中(如1/8视野)各类细菌数，然后估计全视野中的各类细菌数［2］。该方法虽然由于所需设备简单，操作简便，耗时短，很适宜临床应用。但是并不能完全反映肠道菌群的状态，更不能对细菌种类及数量进行精确定量，而且操作过程受主观因素影响较大，不易于推广。2活菌定量培养计数法Hartemink等人［3］于1997年提出了活菌定量培养及计数的方法，即将一定质量的粪便标本，悬浮于PBS中，经连续10倍稀释，分别接种于不同的选择培养基中，进行培养。对不同培养基选取最佳分布菌落进行计数，并根据其相应稀释倍数而得到细菌在标本中的含量。此法可以同时显示肠道菌群的多样性和比例构成。但是，目前选择性培养基并不能真正做到完全特异性选择，仍有85%的肠道菌群无法培养得到。而且稀释平皿接种费时，通常孵育需2～3d，如果微生物分布不均，呈链状或成丛，则导致低估真正菌数。平皿接种中的氧化作用会杀死像双歧杆菌这样的厌氧菌，影响菌数的估计。3聚合酶链式反应技术(polymerasechainreaction，PCR)16SrRNA是编码细菌核糖体16S小亚基的核酸序列，而16SrDNA是编码它的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16SrRNA基因可分为保守区和可变区，在不同的微生物可变区其核苷酸序列不同，一个16SrRNA的基因序列就代表着一种原核生物［4］。16SrRNA/rDNA分子是研究微生物的最佳靶分子，利用保守区系列设计通用引物来判断细菌的存在与否，也可以利用16SrDNA可变区特异性序列来进行特异性微生物种属鉴定和分型，这在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。基本过程是:先用PCR法扩增模板DNA，然后对扩增片段进行测序，获182第22卷第3期航空航天医学杂志2011年3月得新的特征性序列。该技术可检测肠道中不能培养或生长缓慢的细菌，加速发现新的细菌和加快肠道微生态研究进程，但也存在局限性和偏差，需要从优化电泳及PCR条件着手改善或与其他技术方法结合使用、互为补充［5］。4荧光原位杂交(fluorescentinsituhybridization，FISH)首次由于Delong于1989年用于微生物学，此技术是将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片上的细胞进行杂交，固定过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸，用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞。Langendijk等［6］已应用此技术检测粪便样品中双歧杆菌，其用荧光标记靶16SrRNA寡核苷酸探针，使用显微镜测定粪便样品中双歧杆菌中的数量。Harmsen等［7］曾设计7种16SrRNA寡核苷酸探针来检测人粪便样品中6种厌氧菌(Phascolarctobacterium，Veillonella，Eubacteriumhallii，Lachnospira，Eu2bacteriumcylindroids，Ruminococ-cus)，能检测到细菌总数的90%。尽管FISH的方法已有很大进展，但还存在一些问题。以后灵敏度的提高、新探针标记方法及高强度荧光染料的开发，各种检测仪器的更新改进，细胞固定和透过处理方法优化都是必要的。5DNA指纹图谱技术变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectropho-resis，DGGE)DGGE现在已经成为常用的一种16SrRNA/rDNA指纹技术，可从通常的扩增产物分开单独的rRNA基因，具有简单、快速、灵敏的优势。基本做法:从胃肠道标本中提取总DNA，用通用引物PCR法扩增16SrDNA，由于不同细菌的16SrDNA片段在通过DGGE凝胶时在不同的尿素和甲酰胺浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中发生部分变性而迁移速度明显下降，从而将16SDNA片段分离并产生细菌群体的图谱。通过指纹图谱比对有利于发现新的菌群和监测肠道菌群的多样性变化。温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectro-phoresis，TGGE)温度梯度凝胶电泳(TGGE)是继DGGE之后发展起来的DNA指纹图谱技术，与DGGE不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度而是温度梯度以及在引物的5'端加入30～50bp的GC片段(GC2clamp)。16SrRNA基因进行PCR后扩增产物带有较高解链温度GC片段，在不同温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，由于序列不同的DNA分子的解链速度和程度不同，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使不同序列的DNA分子分开并留下指纹印迹。应用此技术能快速地检测单独区系菌群的构成，也可以发现存在的尚未被认识的肠道细菌。LIONETTI等［8］运用该技术对儿童克罗恩病患者的肠道营养和微生物群落进行了研究。DNA指纹技术也有其限制性，只能分离较小的片段(最长只达1000)因此只能提供有限的信息，片段太长时解离率下降，限制了系统发育分析和探针的序列信息量;再者分辨率低，通常显示的是群落中优势种类的DNA片段。6实时荧光定量PCRFQ－PCR技术创立于1996年，由美国AppliedBiosys-tems公司推出，是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。FQ－PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。FQ－PCR技术融合PCR技术和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭系统下完成，并在电脑分析软件支持下实现对PCR扩增产物的动态监测和自动定量。罗予等［9］利用实时荧光引物证实脆弱类杆菌可以与大肠埃希菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌相鉴别，最低受检细菌数为102。FQ－PCR的特点主要有以下几个方面:(1)定量原理独特，用产生荧光信号的多少来显示扩增产物的量，动态实时连续荧光监测，具有很好的可视性;(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大地提高了检测的灵敏度、特异性和精确性;(3)只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速;(4)结果重现性好，定量动态范围高达五个数量级。FQ－PCR作为PCR技术的发展，自1996年已来，在科研及临床诊断的许多领域显现出它的优越性，现在已广泛应用于生物学、基础医学、疾病诊断、食品、水质环保、药物开发等领域，被认为是核酸定量的金标准。7小结了解肠道菌群在宿主体内的量，一方面可以有助于判断菌群平衡状况，另一方面又可以为疾病的诊治提供依据。在没有掌握PCR等分子生物学手段的情况下，早期人们通过粪便涂片镜检法及细菌培养、显微镜下菌细胞计数来定量细菌，不仅费时而且对操作者的专业经验要求很高。20世纪80年代中后期，人们试图用免疫学方法找到特定细菌产生特定抗原或代谢产物和细菌量之间的结合点。20世纪90年代分子生物学技术的迅猛发展为细菌定量技术的研究提供了广阔的空间，加之各种灵敏荧光染料的开发及各种检测仪器的发展，使人们对微生物群体多样性有了更科学、更直接的认识，而且对微生态群落结构的分析能够更精确的定量。通过以上各种方法的比较，我们有理由相信实时荧光定量PCR技术应用于肠道菌群的定量研究将会使我们逐渐了解到微生态系中微生物群体的多样性及实际生存状态，而且通过方法学评价，相信FQ－PCR技术必将在肠道微生态研究中发挥越来越重要的作用。参考文献1康白.微生态学［M］.第1版.大连:大连出版社，1998:200～221.2刘勇.胃肠微生态学检测方法及临床意义［J］.中国实用内科杂志，2006，26(13):963～965.3HARTEMINKR，DOMENECHVB，ROMBOUTSFM.LAMVAB－Anewselectivemediumfortheisolationoflac2tobacillifromfaeces［J］.MicrobiolMeth，1997，29(1):77.282Vol.22No.3JournalofAerospaceMedicineMar20114苏勇，朱伟云.分子生物学技术在胃肠道微生态中应用研究进展［J］.生物技术通报，2006，21(4):73～77.5黄菁华，张荣昌，申玉军.16SrRNA基因检测技术在肠道微生态研究中的应用［J］.山东畜牧兽医，2007，29(2):49～51.6LangendijkPS，SchutF，JansenGJ，etal.QuantitativefluorescenceinsituhybridizationofBifidobacteriumspp.withgenus－specific16SrRNA－targetedprobesanditsapplicationinfecalsamples.ApplEnviro