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HIV、TP、HCV的检验及意义HIV实验室检测检测样本•HIV抗体酶免--血清/血浆，尿液快速检测--血清/血浆/全血，唾液•CD4：抗凝全血•病载、基因型、耐药：血浆样本保存•抗体检测：短期（1周）内进行检测的可存放于2～8℃，一周以上应存放于-20℃以下。筛查阴性样品，建议至少保存1～2个月；筛查阳性样品，无论确证结果如何，均应将剩余的样品保存至少10年•核酸检测：血浆4天内进行检测的可存放于4℃，3个月以内应存放于-20℃以下，3个月以上应置于-70℃以下。•CD4：室温（18～25℃）保存和运输。要求48小时内染色，染色后6小时内分析；如采血后24小时内染色，可在染色后24小时内分析。HIV抗体检测•筛查试验酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光或免疫荧光试验快速检测（RT）•确证试验免疫印迹试验（WB）条带免疫试验放射免疫沉淀试验（RIPA）免疫荧光试验（IFA）初筛和复检流程样品初筛试验筛查试剂阳性反应阴性反应复检试验原有试剂+另一不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂均阳性反应一阴一阳均阴性反应确证试验报告阴性图1HIV抗体筛查检测流程确证流程质量控制•试剂盒内部对照：按照试剂盒要求设置•使用室内质控品：外购、阳性对照/样本稀释•ELISA检测20次内—即刻法质控20次后，Levey-Jennings质控图更换试剂厂家必须重新制作质控图，同种试剂不同批号可继续使用（注明批号）发现失控、位移及时查找原因，必要时重新开始质控•快速检测更换批号进行质量验证注意反应时间、温度、数量控制设备检定、维护•强检设备酶标仪、移液器、高压锅、温度计（可自行比对）•自行维护生物安全柜、洗板机、洗眼器、水平（梅毒）旋转仪•温度控制冰箱、温箱/水浴箱内放置经检定（比对）的温度计•高压灭菌放置指示卡•洗眼器定期进行维护SOP文件•（1）样品的接收、登记、处理、保存和运输；•（2）检测方法和步骤；•（3）试剂使用和保存；•（4）仪器的使用维护和校准；•（5）质量控制要求及程序；•（6）结果解释与报告；•（7）保密程序；•（8）实验室数据、相关文件记录与保存；•（9）不确定样品追踪和处理；•（10）实验室安全防护及实验室的清理和消毒。实验室记录•检测登记表•试验原始记录（ELISA、快速、RPR/TURST）•报告单/化验单复检化验单—筛查阳性填写，信息收集完整•仪器使用、维护保养记录•质控资料•消毒记录•废弃物处理登记•冰箱温度记录•人员健康档案（体检、疫苗接种记录，化验单、体检报告）实验室生物安全•实验室：Ⅱ级生物安全实验室（BSL-2）•建立安全制度：S-SOP、意外事故处理预案、信息安全及保密制度•培训和管理：全员培训、标准防护原则•个人防护：防护用品与设施、健康监护•安全操作：样品采集与管理、仪器设备使用、利器使用•消费与污物处理梅毒实验室检测技术梅毒螺旋体--梅毒的病原体分类：•螺旋体目（Spirochaetales）•螺旋体科（Spirochaetaceae）•密螺旋体属（Treponema）•苍白螺旋体种（Treponemapallidum）•分几个亚种梅毒螺旋体（TP）小而纤细的螺旋状微生物长5～20μm，粗细0.2μm有6～12个规则的螺旋基本结构为一原生质的圆柱体，为两层膜所围绕行动缓慢而有规律-围绕其长轴旋转中前后移动-伸缩其圈间之距离而移动-全身弯曲如蛇行生物学特性-1•免疫性：人对TP产生细胞免疫和体液免疫。细胞免疫对感染过程的影响尚不清楚。•特异性抗体：TP可导致人体产生多种抗体。其中TP的脂质激发机体产生的特异性抗体，在初次感染后产生，保持终生，但对清除机体内的TP无作用。另一些种特异性抗体可与很多种非致病性螺旋体发生交叉反应。生物学特性-2•反应素：TP破坏机体组织，使组织释放一种抗原性心磷脂,以及螺旋体自身的磷脂类物质，可以激发机体产生反应素，能同从动物如牛心肌中提取的心磷脂发生反应，通过试验来检测。反应素水平与梅毒感染过程相平行，抗梅治疗后约半年转阴，但反应素并非感染TP后所特有。生物学特性-3•致病性：自然条件下TP只感染人，尚未证明梅毒螺旋体能产生内毒素和外毒素，致病机理尚不清楚。•传染性：感染早期传染性最强，随着病程的延长传染性越来越小。临床上未经治疗的病人，在感染后1～2年内最具有传染性，一般认为4年以上几乎不通过性接触传染，但保持对胎儿的传染性。•抵抗力：TP在体外仅能存活数小时，40℃时失去传染力，煮沸立即死亡；对干燥特别敏感，一般的消毒剂均能容易将其杀灭。血库的血液和血浆中可存活24小时以上，三日后全部死亡。生存条件•厌氧寄生物，在人体内可长期生存，体外不易存活•干燥、肥皂水及一般消毒剂如1:1000苯酚、新洁尔灭、酒精均可于短时间将其杀死•在血液中4℃经3日可死亡，故在血库冰箱冷藏3日以上的血液就无传染性•温度的影响：41-42℃时可生活1-2小时，在48℃仅半小时即失去感染力，100℃立即死亡。对寒冷抵抗力强，在0℃时，可生活48小时，如将梅毒病损标本置于冰箱内，经1周仍可致病。在低温（-78℃）保存数年，仍可保持其形态、活动及毒性•在封存的生理盐水稀释的组织液中可生活10小时左右•在潮湿的器具或湿毛巾中，亦可生存数小时•在干燥环境中可见迅速死亡宿主•梅毒螺旋体只感染人类•人是梅毒的唯一传染源传播途径性接触是主要的传染途径未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性随着病期的延长，传染性越来越小到感染后4年，通过性接触一般无传染性母婴传播在妊娠7周时，梅毒螺旋体即可通过胎盘传染（未经治疗者），病期4年虽已无性传播，但妊娠时仍可传染给胎儿,病期越长，传染性越小;常用梅毒实验室检测方法•病原学检测•血清学检测病原学检查•原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。•方法：（1）暗视显微镜检查（2）镀银染色法（3）核酸检测（血液标本？）注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功，仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。病原学检查的临床意义•螺旋体检查是诊断早期梅毒的最佳方法，对于患者的早期诊断、及时治疗、预后和尽早切断传染源都有十分重要的意义。•如未见到梅毒螺旋体，并不能排除患梅毒的可能性。梅毒血清学检测方法(1)非梅毒螺旋体抗原血清学试验（非特异性梅毒抗体）(2)梅毒螺旋体抗原血清学试验（特异性梅毒抗体）两类方法。问题：为什么梅毒诊断需要上述两类血清学检测方法？非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理•梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。•未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。问题：临床上非梅毒螺旋体抗原血清学试验为什么需要做定性和定量两种检测方法？非梅毒螺旋体抗原血清学原理•方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)（2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验(VDRL)等。•基本成分是心磷脂卵磷脂和胆固醇•抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见•上述方法的敏感性和特异性都基本相似非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1、仪器：水平旋转仪，转速？转幅？2、定性试验加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：水平旋转仪旋转8分钟(23℃-29℃），亮光下观察结果？滴/mL，1滴=？ul非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1、仪器：水平旋转仪，转速、转幅2、定性试验加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原反应：水平旋转仪旋转8分钟(23℃-29℃），亮光下观察结果60滴/mL，1滴=17ul100r/min约18mm非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点3、定量试验稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。下同定性试验。？1:21:41:81:161:321:641:2561:1281:512定量试验结果判断血清稀释度结果？1:21:41:81:16+----？++---？++++-？问题：定量试验原倍血清滴度是多少？问题：定量试验血清稀释需要使用试管吗？非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点3、定量试验稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。下同定性试验。1:11:21:41:81:161:321:641:2561:1281:512定量试验结果判断血清稀释度结果1:11:21:41:81:16+----1:1++---1:2++++-1:8TRUST1:16非梅毒螺旋体抗原血清学试验结果判断RPR1:2561:11:21:41:81:161:11:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:321:641:1281:2561:512非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后•一期梅毒1年后转为阴性•二期梅毒2年后转为阴性。•晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义•非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。•因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。梅毒病期敏感性(%)特异性(%)一期86（77-99）-二期100隐性98(95-100)（一般滴度1:8，但不排除1:8）晚期73非梅毒-98(93-99)非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点假阳性反应•技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。•生物学假阳性反应(一般滴度小于1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排除。假阴性反应：前带现象、后带现象血清固定：临床问题梅毒螺旋体抗原血清学试验原理•抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。•感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。问题：梅毒螺旋体抗原血清学试验的定量试验在梅毒诊疗中有意义吗？梅毒螺旋体抗原血清学试验方法•梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)•梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)•梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）•化学发光免疫分析法（CLIA）•梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)•荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）•梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）TPPA•TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒与人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。•TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。+明胶颗粒梅毒抗原+抗原致敏颗粒抗原致敏颗粒血液中抗体抗原抗体凝集TPPA试验原理示意图414+：粒子光滑覆盖整个孔底，有时边缘有折叠3+：粒子光滑覆盖大部分底2+：粒子光滑聚集覆盖孔底，周围有一细胞环1+：粒子光滑集聚覆概孔底，周围有一明显细胞环±：粒子沉集孔底，中央形成一小点–：粒子紧密沉积孔底中央TPPA试验结果判读敏感性特异性病期一期二期隐性临床试验a100100100美国CDC8810010095a:均为RPR阳性标本ELISA/CLIA•ELISA试验是用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条，加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物，形成抗原抗体复合物与酶标记物结合，用酶联检测仪判定试验阳性反应。•本法可用于大样本血清检