2015年分子生物学实验技能

分子生物学实验技能邢晓为副研究员中南大学湘雅三医院医学实验中心研究生课程内容提要分子生物学的基本概念及其应用基本的生物信息分析技术分子生物学实验的基本技能一、分子生物学基本概念定义：在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等，阐明各种生命现象本质的科学。分子生物主要研究内容核酸的分子生物学蛋白质的分子生物学细胞信号转导的分子生物学1.核酸的分子生物学核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。由于从上世纪50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。中心法则DNARNA蛋白质DNA（Deoxyribonucleicacid）:脱氧核糖核酸,是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料DNADNA双螺旋结构1953年沃森和克里克提出了DNA的双螺旋结构,开创了分子生物学的新纪元。并在此基础上提出的中心法则，描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动A-TG-CgDNA（基因组DNA）plasmidDNA（质粒DNA）mtDNA（线粒体DNA）ssDNA(鲑鱼精DNA)cDNA(互补DNA)rDNA(核糖体DNA,rDNA就是可以转录产生rRNA的基因)T-DNA(也叫三螺旋DNA，是指一种由三股ssDNA旋转螺旋行成的一种特殊结构,T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素)常见的DNA符号RNARNA(RiboNucleicAcid)：核糖核酸，是由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸,因含核糖而得名,简称RNA。RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。在RNA病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。RNA一般是单链线形分子;也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA；1983年还发现了有支链的RNA分子。RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。其中，U（尿嘧啶）取代了DNA中的T（胸腺嘧啶）而成为RNA的特征碱基。在细胞中，根据结构功能的不同，RNA主要分三类:tRNA（转运RNA）rRNA（核糖体RNA）mRNA（信使RNA）mRNA是合成蛋白质的模板，内容按照细胞核中的DNA所转录；tRNA是mRNA上碱基序列（即遗传密码子）的识别者和氨基酸的转运者；rRNA是组成核糖体的组分，是蛋白质合成的工作场所。常见的RNA符号mRNA信使RNAtRNA转运RNArRNA核糖体RNAcRNA(互补RNA,可用分子作杂交探针)hnRNA(基因转录初产物,在细胞核内不稳定)RNAi,shRNAmiRNA(真核生物内源性的小分子单链RNA，通常18-25nt长，能够与靶mRNA特异性的碱基配对引起靶mRNA的降解)基因基因：是位于染色体上的遗传功能单位，是编码蛋白质（酶）或RNA的一段双链DNA片段。基因座（locus/loci）：每一对基因分别位于来自双亲的染色体的同一位置上，这个位置称为~。等位基因：一对同源染色体同一基因座上的一对基因称为一对等位基因（allele）。复等位基因：在一个群体中，每一个基因座位上可以有2个以上等位基因，这就是复等位基因（multipleallele）。假基因（pseudogene）：与功能基因相似的序列，但由于突变等原因，不能转录或能转录但不能剪接形成成熟mRNA分子。这些序列称为~。超基因（supergene）:是指作用于一种性状或作用于一系列相关性状的几个紧密连锁的基因。基因外显子、内含子基因一般结构5'3'ATGTAATGATAG外显子：出现在成熟mRNA分子中的基因序列。内含子：不出现在成熟mRNA分子中的基因序列。2.蛋白质的分子生物学蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。蛋白质是一种复杂的有机化合物,是由氨基酸分子呈线性排列所形成，相邻氨基酸残基的羧基和氨基通过肽键连接在一起。蛋白质的氨基酸序列是由对应基因所编码。3.细胞信号转导的分子生物学细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。分子生物学的临床应用亲子鉴定基因诊断产前诊断图1应用AC，AB引物PCR扩增α地贫风险胎儿结果1、2为正常人;3患儿父亲;4患儿;5患儿母亲;6胎儿脐带血标本;MMarker地中海贫血基因诊断与遗传咨询邢晓为李麓芸傅俊江等【摘要】目的研究就诊病人中地中海贫血患者的基因突变类型，为更好地开展地中海贫血的产前诊断和遗传咨询工作奠定基础。方法应用PCR技术对9例α地中海贫血患者及1例风险胎儿进行缺失检测;应用等位基因扩增突变不应系统（amplificationrefractorymutationsystem，ARMS）技术对25个β地中海贫血家系（其中22例产前诊断）及7例散发病例的β珠蛋白基因nt-28（A→G）、CD17（A→T）、CD41-42（-CTTT）、CD71-72（+A）、IVS-2nt654（C→T）进行检测。结果α地贫10例标本中9例检测到了大片段缺失。β地贫中，nt-28（A→G）2例，CD17（A→T）11例，CD41-42（-CTTT）21例，CD71-72（+A）0例，IVS-2nt654（C→T）23例。结论在就诊患者中，β地贫主要以点突变为主，其中有三个突变热点，分别为CD41-42（-CTTT）、IVS-2nt654、CD17（A→T）。α地贫的基因改变主要是以大片段缺失为主。该研究将有助于开展地中海贫血病的遗传咨询工作，为进行产前诊断和遗传优生工作奠定基础。胚胎移植前遗传学诊断（PGD）从发育到4-8细胞的胚胎中，取出一个细胞进行细胞遗传学或分子遗传学检查，再将检查正常的胚胎放到子宫中，以达到优生优育的目的。二、基本的生物信息分析技术生物信息学（Bioinformatics）是一门数学、统计、计算机与生物医学交叉结合的新兴学科,它已广泛地渗透到医学的各个研究领域中，成为生物医学发展不可缺少的重要工具。随着人类基因组计划的快速发展，生物信息学技术在人类疾病与功能基因的发现与识别、基因与蛋白质的表达与功能研究方面都发挥着关键的作用。生物信息学技术在基于基因与蛋白质功能缺陷的合理化药物设计方面也有着巨大的潜力。生物信息分析常用网站(基因查找、BLAST比较、domain分析等)（蛋白的分子量、等电点、同源分析、结构分析等）（分析酶切位点）（CpGIslandSearcher）NCBI中基因序列查找常见物种名称Homosapiens(人类)Susscrofa(猪)Rattusnorvegicus(大鼠)Musmusculus(小鼠)Bostaurus(牛)Drosophilamelanogaster(果蝇)Caenorhabditiselegans(线虫)Xenopustropicalis(青蛙)Fugurubripes(真菌)基因阅读框的识别基因组DNA序列的获得内含子与外显子的确定ExonExonsize(bp)5′spliceacceptorIntronsize(bp)3′splicedonor1？GACCCCGGAGgtgaggatgg259tcatccccagGATTGCCCAG1344CCAAACATGAatgagcaagg375ctctctgcagATGACAACAT199GGATGTGTGTgtacgtatat467tcccgtgcagCCTGGTTCAC1308ACACGTGCAGgtgagcaggg562ccctgccttcCAGATGCAAG1076TGTGCTTTCGgtgtgtccca650ggcctcacagGATTCTGGAT2386AGTCTGGCAGgtgagtgtgc735actccaccagGATGACAGCA1279AGAGCTTGAGgtaagaggaa8109tcctgataagGTTGTACCAG596GTCCGATGAGgtgagacgct979gccttttcagCAAAAAATGG5920AAGTCTATAGgtaggtgacc10116tcctatacagGGGCCAGCAT1775GATCCTTGAGgcagggggga11168cctcttctagCCCAACGTGA1756CGTCATCTATgtgagcactc1287ggttccacagGGCATGGAGG550CCCACTCCAGgtacctgcga13153tctcttccagAACCAGCCGG1149TTTACCCCCAgaccaagtctTheboundaryofTSARG4geneexonsandintrons三、分子生物学基本技术PCR检测DNART-PCR检测mRNANorthernblot检测mRNASouthernblot检测DNAWesternblot检测蛋白质组织原位杂交检测mRNAIP检测蛋白质之间的相互作用Pull-down检测蛋白质之间的相互作用酵母双杂交检测蛋白质之间的相互作用1.课题设计与实验方法的选择检测的目的：检测突变、基因多态性、基因的表达、基因定位、基因表达调控、蛋白相互作用等方法的选择：先了解目前检测都有哪些方法，根据实验目的、实验时间、经费选择合适的方法。2.实验取材与保存：实验材料：组织、血液/体液、细胞、病毒等。取材注意事项:(1)取材时动作要迅速，材料尽可能新鲜；(2)注意无菌操作；(3)尽快放入液氮或保存液中；(4)取病理材料时，应加对照等。实验材料的保存：(1)DNA；(2)RNA；(3)蛋白；(4)组织等。3.实验基本技能移液器（加样枪）的使用DNA/RNA的抽提PCR/RT-PCR技术Westernblot技术分子杂交技术（1）移液器的使用和注意温度密闭性轴芯移动速度试剂的蒸汽锁定调节数据读框枪头与tips紧密结合3.DNA抽提DNA主要在细胞核内，核外也有少量称为核外基因的线粒体DNA等。真核细胞基因组DNA提取的主要步骤包括裂解和纯化两大步骤。（1）裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程；（2）纯化则是去除体系中的其它成分，如蛋白质、多糖、脂类及其它不需要的核酸（RNA）等生物大分子的过程。主要步骤1.如果材料为组织块，可将组织块（约200~1000mg）剪碎后，置入液氮中。随后用冰冷的组织捣碎器捣碎，每100mg组织加入1.2ml消化液（100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl，pH8.0，25mmol/LEDTA，0.5