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全国梅毒检测技术规范（试行讨论稿）中国疾病预防控制中心二○一○年八月II前言为了加强全国梅毒检测工作的管理，提高检测质量，根据《中华人民共和国传染病防治法》、《中国预防与控制梅毒规划（2010-2020）》的精神，在卫生部及中国疾病预防控制中心的领导下，性病控制中心组织国内相关领域的专家制订了《全国梅毒检测技术规范》（下称规范）。本“规范”是基于我国目前梅毒检测工作的需要以及梅毒检测技术的发展，对梅毒检测相关的样品采集、检测方法、检测策略、质量管理等做出具体的规范要求，经上报卫生部并获准由中国疾病预防控制中心下发，适用于全国各级医疗、疾病预防控制、妇幼保健、采供血、出入境检验检疫等提供梅毒检测服务的机构。本“规范”起草单位：中国疾病预防控制中心性病控制中心本“规范”参加编写单位：中国疾病预防控制中心艾滋病性病预防控制中心、中国疾病预防控制中心妇幼保健中心、广东省皮肤性病控制中心、江苏省疾病预防控制中心、天津疾病预防控制中心、上海市皮肤性病医院本“规范”参加编写及审核人员：尹跃平、王千秋、王宝玺、邢文革、王临红、郑和平、傅更峰傅更锋、顾伟鸣、郑钟洁、龚匡隆、陈祥生。本《规范》编写工作联系人：魏万慧本《规范》适用于全国所有的梅毒检测实验室。本《规范》解释权属于中国疾病预防控制中心。III目录第一章梅毒及其病原体第二章样品的采集和处理第三章梅毒血清学检测第四章梅毒体病原学检测第五章梅毒核酸检测第六章实验室生物安全第七章梅毒血清学检测实验室质量管理1第一章梅毒及其病原体梅毒是由梅毒苍白螺旋体（Treponemapallidum）引起的一种性传播疾病，可引起神经、心血管等多系统损害，严重影响人群的身体健康。此外，梅毒亦可通过胎盘传给胎儿，导致自发性流产、死产或先天梅毒等。20世纪80年代，梅毒在我国重新出现，90年代末以来，全国梅毒报告病例数明显增加，呈快速流行的趋势，已成为我国重要的公共卫生问题。梅毒可分类为早期梅毒（一期、二期和早期隐性梅毒）和晚期梅毒（三期和晚期隐性梅毒），许多梅毒患者的临床表现并不明显或者缺乏临床症状，病例的发现往往依赖于实验室的检测。梅毒的早期发现和及时治疗对有效预防和控制梅毒的流行具有重要的意义，梅毒的检测是病例发现、临床诊断和疗效观察的重要手段。梅毒的检测方法不仅一直沿用许多传统的方法，而且，随着科学技术的发展，其新的检测技术与方法不断出现并广泛应用。因此，规范各种检测方法、制定不同检测策略、加强质量控制和开展试剂评估等对确保梅毒临床服务和现场防治的质量具有重要的意义。2第二章样品的采集和处理1范围本章规定了用于梅毒检测的各类样品（包括血清、血浆、全血、皮损部位组织液、淋巴穿刺液和脑脊液）的采集和处理方法，适用于梅毒血清学、病原学检测和核酸检测。2规范性引用文件《梅毒诊断标准》中华人民共和国卫生行业标准WS273-2007，2007年《性传播疾病实验室诊断指南》中国疾病预防控制中心性病控制中心，2007年《医疗机构临床实验室管理办法》卫生部，卫医发〔2006〕73号，2006年《病原微生物实验室生物安全环境管理办法》国家环境保护总局,2006年《全国艾滋病检测技术规范》中国疾病预防控制中心，2009年3样品种类及相应的用途3.1血清、血浆、全血及脑脊液可用于梅毒血清学检测或核酸检测。3.2皮损部位组织液、淋巴穿刺液可用于梅毒病原体检测或核酸检测。4操作步骤4.1采样前准备4.1.1根据检测项目的具体要求，确定采集样品的种类、处理、保存及运输的时限和方法，按照临床采样技术规范的要求操作，遵守生物安全要求。4.1.2准备消毒用品、采样用具，包括采血管及试管架、钝刀（刮勺）、载玻片、硬质废弃物容器等。4.1.3选择合适的采样空间，受检者坐（卧）于合适的位置。4.1.4根据样品编码的原则和方法，制定唯一性编码（编号），保证其唯一性。4.1.5使用样品记录本或登记表记录样品。4.2采集和处理样品4.2.1血液4.2.1.1血清：根据需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取静脉血，室温下自然放置1～2h，待血液凝固、血块收缩后再用1500～3000r/min离心15min，吸出上层血清，置于合适的容器中，备用。4.2.1.2血浆：根据需要，用抗凝真空采血管抽取静脉血，1500～3000r/min离心15min，吸出上层血浆，置于合适的容器中，备用。4.2.1.3末梢全血：消毒局部皮肤（成人和1岁以上儿童可选择耳垂、中指、无名指或食指。13岁以下儿童采用足跟部）。用采血针刺破皮肤，收集滴出的血液，备用。4.2.2皮损部位组织液4.2.2.1用于病原学检查：用无菌生理盐水浸湿的棉拭子擦去皮损表面的污物，钝刀轻刮、挤压皮损表层，取渗出液与预先滴加在载玻片上的生理盐水混合后加盖玻片。4.2.2.1用于核酸检测：用无菌生理盐水浸湿的棉拭子檫去皮损表面的污物，钝刀轻刮、挤压皮损表面，取渗出液洗入细胞裂解缓冲液(1mL/管）的标本管中。4.2.3淋巴穿刺液：无菌操作下穿刺淋巴结，注入生理盐水并反复抽吸2～3次，取少量的淋巴液直接滴于载玻片上，加盖玻片。4.2.4脑脊液：采用腰椎穿刺术获得，应由相关专业人员操作。4.3样品的保存4.3.1如标本需要保存，采样前应对样品管或玻片进行核对并编码。要将标签贴在试管的侧面或玻片的一侧，最好使用预先印制好的、专门用于冷冻储存的耐低温标签。4.3.2血清或血浆样品，短期（1周）内进行检测的可存放于2～8℃，一周以上应存放于低于-20℃的条件下。4.3.3病原学检查用组织液、淋病淋巴穿刺液标本需要首先将标本涂于干净载玻片，然后使用固定液进行固定、自然干燥干燥后可置于2～8℃下保存。4.3.4核酸检测用组织液、淋病淋巴穿刺液等标本均应置细胞裂解缓冲液后，放于—70℃冰箱中保存。4.4样品的运送4.4.1应符合生物安全要求；获得相应部门批准并由具有资质的人员专程护送。4.4.2应采用三层容器对样品进行包装，随样品应附有与样品唯一性编码相对应的送检单。送检单应标明受检者姓名、样品种类等信息，并应放置在第二层和第三层容器之间。4.4.2.1第一层容器：直接装样品，应防渗漏。样品应置于带盖的试管内，试管上应有明显的标记，标明样品的唯一性编码或受检者姓名、种类和采集时间。在试管的周围应垫有缓冲吸水材料，以免碰碎。4.4.2.2第二层容器：容纳并保护第一层容器，可以装若干个第一层容器。要求不易破碎、带盖、防渗漏、容器的材料要易于消毒处理。4.4.2.3第三层容器：容纳并保护第二层容器的运输用外层包装箱。外面要贴上醒目的标签，注明数量、收样和发件人及联系方式，同时要注明“小心轻放、防止日晒、小心水浸、防止重压”等字样，还应易于消毒。4.4.2.4运送样品必须有记录。4.4.2.5特殊情况下经有关部门批准可以用特快专递邮寄样品，但必须按三层包装，将样品管包扎好，严禁使用玻璃容器。44.5样品的接收4.5.1样品包裹必须在具有处理感染性材料能力的实验室内、由经过培训的、穿戴防护衣、戴口罩、防护眼镜的工作人员在生物安全柜中打开，用后的包裹应及时进行消毒。4.5.2核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏。如发现溢漏应立即将尚存留的样品移出，对样品管和盛器消毒，同时报告实验室负责人和上一级实验室技术人员。4.5.3检查样品的状况，记录有无严重溶血、微生物污染、血脂过多以及黄疸等情况。如果污染过重或者认为样品不能被接受，应将样品安全废弃。并将样品情况立即通知送样人。4.5.4接收样品时应填写样品接收单。5第三章梅毒血清学检测1范围本章规定了梅毒血清学的检测方法、程序、结果报告、检测策略及质量控制。2规范性引用文件《梅毒诊断标准》中华人民共和国卫生行业标准WS273-2007，2007年《性传播疾病实验室诊断指南》中国疾病预防控制中心性病控制中心，2007年《SexuallyTransmittedDiseasesTreatmentGuidelines》美国疾病预防控制中心，2006年《Theuseofrapidsyphilistests》WHO/TDR,2006年3实验室基本要求实验室建筑与设施应符合《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》（中华人民共和国卫生行业标准，WS233-2002）中Ⅱ二级生物安全防护实验室的规定，实验室人员应定期接受专业培训，配备相应的设备（如水平旋转仪等），以满足梅毒实验室检测工作的需要。4检测目的与要点4.1检测的目的4.1.1梅毒血清学检测可用于临床诊断、血液筛查、流行病学监测等。4.1.2以临床诊断为目的的检测是为了确定梅毒感染的状况。4.1.3以血液筛查为目的的检测是为了防止梅毒的经血传播。4.1.4以流行病学监测为目的的检测是为了调查梅毒血清学感染率和发病率。4.2检测要点4.2.2根据目的选择检测方法及检测策略。4.2.4可采用任何一类梅毒血清学检测方法作为筛查试验。5．检测方法分类梅毒血清学检测包括非梅毒螺旋体试验（非特异性梅毒抗体检测试验）和梅毒螺旋体试验（特异性梅毒抗体检测试验）两类方法。5.1非梅毒螺旋体试验，包括快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)、甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）、性病研究实验室试验(VDRL)等。5.2梅毒螺旋体试验，包括梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)、梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)、梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）、化学发光试验、梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(TP-RT)、FTA-ABS、梅毒IgM抗体检测（TP-IgM）和梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）等。6．不同血清学检测方法及其所需的检测样品6检测方法样品种类血清血浆末梢全血脑脊液非梅毒螺旋体试验快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）性病研究实验室试验(VDRL)梅毒螺旋体试验梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（TP-ELISA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(TP-RT)荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）化学发光免疫测定试验（CLIA）梅毒IgM抗体检测（TP-IgM）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（TP-WB）7．检测试剂所有应用于临床的检测试剂均必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂，其中RPR、TRUST、TP-ELISA应有批批检合格证。推荐使用临床质量评估敏感性和特异性高的试剂。8．检测方法8.1非特异性梅毒抗体检测非特异性梅毒抗体检测是以一定比例的心磷脂、卵磷脂及胆固醇混合物作为抗原，根据检测目定性或定量检测梅毒患者血中的抗类脂抗原的抗体。8.1.1快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）-定性试验采用血清或血浆标本，置试验卡片的圆圈中，并均匀涂满整个圈内，在每个标本中准确地加1滴（17L）抗原，将卡片置于水平旋转仪上旋转8min，100±2r/min，立即在亮光下用肉眼观察结果。8.1.2快速血浆反应素环状卡片试验（RPR）-定量试验定量试验是将原血清或血浆标本先在卡片的圆圈中中进行对倍倍比稀释后，再按照定性试验的方法对每一个稀释度的标本进行检测和观察结果。8.1.3甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）-定性和定量试验具体方法同RPR定性试验和RPR定量试验。8.1.4性病研究实验室试验（VDRL）-定性试验采用0.05mL血清或脑脊液标本置入反应板圈中，将血清涂布到整个圈内，用标准针头加入1滴（17L）抗原，并将反应板置水平旋转仪上旋转4min，180±5r/min，立即置低倍显微镜下观7察。8.1.4性病研究实验室试验（VDRL）-定量试验定量试验是将原血清或脑脊液标本先在反应圈中进行对倍稀释后，再按照定性试验的方法对每一个稀释度的标本进行检测和观察结果。8.2特异性梅毒抗体检测8.2.1梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA）TPPA试验是用超声裂解梅毒螺旋体抗原，致敏明胶粒子，其致敏粒子与待检血清或血浆中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的凝集，有效试验的阴性和阳性对照必须符合