毒理学实验

卫生毒理学实验所必需的基本理论知识(一）实验动物的选择１．实验动物种属与品系的选择：实验动物种属的选择原则是：对外来化学物的毒作用反应与人类一致，易于获得，易于品系纯化，易于饲养、管理，便于操作，价格合理。为了有利于预测化学物对人体的毒性作用，通常要求选择二种或二种以上的实验动物，如一种为啮齿类，一种为非啮齿类.２．实验动物个体的选择：(1)．年龄：急性实验一般选用成年动物，慢性实验多选用年幼动物。(2)．性别：如无特殊要求，宜选用雌雄各半。实验动物（以大、小鼠为例）性别的辨认方法是：大鼠与小鼠主要依肛门与生殖孔的距离区分。间距大者为雄性，小者为雌性。成年雌性在腹部还可见乳头，雄性动物卧位时可见到睾丸。(3)．体重:小鼠：18~25g,大鼠：180~240g，组内个体间体重差异应小于10%，各组间平均体重差异不应超过5%。(4)．健康状况：实验动物必须是健康的.健康的标志是：健康动物外观为体型丰满，发育正常，被毛浓密有光泽，紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲与营养状况良好。(5)．生理状况：一般毒理实验中，通常不用怀孕或授乳的动物，但在某些特殊的毒理实验则必须选择。一般实验中常将雌雄分笼饲养。(6)．数量：依实验的目的及满足统计学要求来确定数量。（二）实验动物的编号与分组：编号:(1)染色法：可用苦味酸或品红(2)剪耳法2．随机分组为了得到客观的剂量—反应关系，应将一群动物依据统计学原随机分配到各试验组中，可按随机数目表方法随机分组。：设30只雄性动物平均分成A、B、C、D、E、F六组，每组5只动物。将已称重编好号的动物，依号码用随机数目表分配(随机数目表见表3)。如随机数目表第二行，从第一个数目开始，依次抄下30个数目(依横行、纵行、甚至斜行抄录均可)。将各数目一律以组数6除，以余数1、2、3、4、5、0代表应分配于A、B、C、D、E、F各组的动物，结果如下表（从第二行随机数表开始）。表1动物随机分组表动物号123456789101112131415随机数目977424676242811457204253323732除6余数120120323205212归组ABFABFCBCBFEBAB动物号161718192021222324252627282930随机数目270736075124517989731676622766除6系数310130315144230归组CAFACFCAEADDBCF按上法分组后，A组有动物7只，B组7只，C组6只，D组与E组各2只，F组6只。为使各组动物数均达到5只，再依随机分配原则选A组2只，C组1只给D组。B组选2只，F组选1只给B组。继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F各组动物数。计算如下，56／7除尽，即将A组第7只动物(25号)给D组；再下50／6，余数为2，即将A组第2只动物(4号)给D组；再下26／6余数为2，即将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整归组如下表(表2)：雌性动物也依上法分组，然后将雌、雄动物合组进行实验表230只小鼠随机分组组别鼠号A114171923B5810815C76202229D49252627E26122428F311182130（三）实验动物染毒方法：实验中需要由何种途径染毒，则依毒物的形态（气体、液体或粉尘等）、实验的目的、毒物的性质及其作用特点和该物质的用途等因素而定。常用的染毒方法(1).灌胃法：染毒剂量能够准确掌握，操作也不太复杂，多用于急性、亚急性实验。灌胃应当在动物空腹时进行且一次灌胃量一般不应超过动物体重2-3%。小（大）白鼠灌胃：用左手将小白鼠固定（用布包好大鼠，左手抓大鼠背侧包布固定），尽可能使小（大）鼠呈垂直体位，右手持连接好注射器的针头，使弯曲面向腹侧，将针头对准正中线插入口腔，沿咽后壁中线徐徐向后向下插入，切不可偏斜，遇有阻碍则后退稍许，再徐徐进针，一般插入约2-2.5cm(3-4cm)即可到达食道下端。此时可将注射器向外抽去，如无气体抽出，则可确证针头已插入食道中，即可将一定量毒液注入；如有大量气泡抽出则证明针头插入气管，须立即拔出针头,重插。(2)．喂饲法(3).静式染吸入毒(4)．动式吸入染毒(5)．腹腔注射染毒：吸收很快，操作也较简便，在急性实验中比较研究某些物质的毒性或实验治疗研究中有时采用。大、小白鼠腹腔注射：左手拇指及食指提起鼠耳及头后皮肤，以无名指及小指将鼠尾捏在手掌间，使鼠头部略向下，腹部朝上，右手持接有5号针头的注射器，将针头自腹部下外侧向头部方向水平刺入少许，再该为垂直向深部刺入腹腔，抽动注射器针芯，如无回血及尿液，即可注射。(6)．皮下注射染毒：大、小白鼠皮下注射部位可为颈后、两肩胛骨之间或腹部皮肤。左手持镊子或用拇食二指夹起皮肤，右手持注射器水平刺入皮下，回抽针芯如无回血，即可注入。如局部部位隆起，即证明已注入。采血的主要方法：(1)大、小鼠的剪尾采血(2)静脉取血法如兔耳缘静脉，大鼠尾静脉等。(3)后眼眶静脉丛取血法操作者以左手拇、食两指紧紧握住大鼠或小鼠颈部压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血，但用力要恰当，以防止动物窒息死亡。右手持玻璃毛细管从右眼或左眼内眦部以45°角刺入，捻转前进，如无阻力可继续刺入，有阻力就抽出玻璃毛细血管调整方向后再刺入，直至出血为止。右手持容器收集血液。然后拨出毛细管，用干棉球压迫止血。(4)抠眼球采血法(又称眶动脉或眶静脉采血)(5)动脉取血法(6)心脏穿刺取血法(7)断头采血急性毒性试验的目的:求出致死剂量及其他急性毒性参数;观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的毒效应特征;为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据;为毒理学机制研究提供线索急性毒作用带：Zac=LD50/LimacLD50计算改进寇氏法要求：（1）各组n要一致，组距等比。（2）死亡率呈正态分布。（3）最低剂量组死亡率20%,最高剂量组死亡率80%。改进寇氏法计算公式：logLD50=m=Xk-i(∑p-0.5)Sm＝Xk---最高剂量组对数值；∑p---死亡率总和；q---1-p;i---相邻两组剂量对数值之差;n---每组动物数X=log-1(logLD50+1.96SlogLD50)或者X=log-1(m+1.96Sm)致突变作用：广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用致突变物：凡能引起生物体遗传物质发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变剂。遗传毒物;由于致突变物能损伤遗传物质，因此致突变物又称为遗传毒物。观察效应终点的类型：(1)DNA完整性改变(2)DNA重排或交换(3)DNA碱基序列改变（基因突变）(4)染色体完整性改变（染色体畸变）(5)染色体分离改变（非整倍体和多倍体）遗传学终点现象致突变试验DNA完整性的改变形成加合物/断裂/交联细菌DNA修复试验彗星试验DNA重排或交换DNA修复合成、重组SCE试验DNA碱基序列改变基因突变Ames试验染色体完整性改变染色体受损断裂等微核试验,染色体畸变分析染色体分离改变整倍体或非整倍体微核试验、染色体畸变分析Ames试验原理：检测受试物诱发鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株(his-)回复突变成野生型(his+)的能力。即组氨酸突变菌(his-)在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长；回复突变成野生型(his+)，可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长。❖是应用最广泛的检测基因突变的体外试验。微核实验：是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。致畸试验：是评价化学物质是否具有致畸作用的一种传统标准方法，即通过在器官形成期对妊娠动物染毒，在妊娠末期观察胎仔有无发育障碍和畸形来评价受试物致畸作用的方法。致畸试验的头部检查：(四片刀法）切面1：经口沿舌上经耳后做一切面，检查上颚有无腭裂，有无舌缺失，裂舌或舌分叉。切面2：切下颅顶部沿双眼球前沿垂直做额状切面，检查鼻道有无扩大或单鼻道，鼻中隔是否正常等。切面3：沿双眼球正中垂直作第二个额状切面，检查是否存在少眼，小眼，无眼或异位等。切面4;沿双眼球后沿垂直做第三个额状切面检查有无脑室扩大