DNA复制和RNA转录

1§1DNA生物合成的种类和方式DNA指导下的DNA复制RNA指导下的DNA复制DNA复制的忠实性2分子遗传的中心法则DNA是遗传信息的储存和发布者，它在如图的联系中处于中心地位3复制：以亲代DNA或RNA为模板，根据碱基配对的原则，在一系列酶的作用下，生成与亲代相同的子代DNA或RNA的过程。转录：以DNA为模板，按照碱基配对原则合成RNA，即将DNA所含的遗传信息传给RNA，形成一条与DNA链互补的RNA的过程翻译：亦叫转译，以mRNA为模板，将mRNA的密码解读成蛋白质的氨基酸顺序的过程逆转录：以RNA为模板，在逆转录酶的作用下，生成DNA的过程中心法则的几个基本概念4§1.1.1DNA复制的特点•半保留复制•半不连续复制§1.1DNA指导下的DNA复制5半保留复制以亲代DNA双链为模板，按照碱基互补方式合成子代DNA，这样新形成的子代DNA中，一条链来自亲代DNA，而另一条链则是新合成的，这种复制方式叫半保留复制6半保留复制的实验依据1953年,Watson和Crick提出DNA的半保留复制机制1958年,Meselson和Stahl将同位素15N标记的15NH4Cl加入大肠杆菌的培养基中培养12代，使大肠杆菌的DNA都带上15N的标记，然后将该大肠杆菌转入14N的普通培养基中培养后，分离子一代、子二代、子三代、子四代DNA，进行氯化铯密度梯度离心，实验证明了DNA的半保留复制7半保留复制的实验依据8DNA复制的起点和方向9两个起点，两个生长端的相向复制DNA每条链有1个复制起点，分别合成1条新DNA，两条新链相向合成，每个生长点只有1条链合成，这种方式存在于线性DNA病毒1个起点，1个复制区的单向复制DNA两条链的复制起始点在同一位置，复制向一个方向运动，两条DNA链均被复制，这种方式偶见于一些环形DNA的复制1个起点，两个复制区的双向复制这种DNA复制方式最为普遍，复制起始于1个位点，形成两个复制区向相反方向运动，在每个复制区两条DNA链均被复制DNA复制的起点和方向10DNA复制的起点和方向11半不连续复制DNA双螺旋的两条链是反向平行的，而合成方向只能是5‘3’。所以在DNA复制时，1条链的合成方向和复制叉的前进方向相同，可连续复制，称为前导链；而另一条链的合成方向和复制叉的前进方向正好相反，不能连续复制，只能分成几个片段合成，称为滞后链。滞后链的片段叫作冈崎片段(~1000b)，它们合成后再连接起来（前导链）（滞后链）冈崎片断12§1.1.2DNA复制的酶系13拓扑异构酶解开超螺旋14拓扑异构酶解开超螺旋DNA拓扑异构酶催化的反应本质是先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的链环数之后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能其断裂反应与连接反应是相互偶联的，不能连接事先已经存在的断裂DNA15解链酶和SSB的作用16引物酶合成RNA引物17DNA聚合酶延长子链18原核细胞DNA聚合酶19连接酶连接2个冈崎片断20连接酶连接2个片断的三步反应21DNA复制酶系总览22§1.1.3DNA的复制过程23解旋：由拓扑异构酶解除DNA的超螺旋结构解链：由解链酶使双链DNA解开再由单链结合蛋白与单链结合，防止氢键再形成识别起点：由DNA指导的RNA聚合酶即引物酶完成生成引物：以DNA为模板在引物酶催化下由DNA转录成DNA的生成：在RNA引物3末端上按碱基互补原则经DNA聚合酶III催化生成，其3末端与下一个RNA引物5末端相连DNA的合成步骤24切除引物：由DNA聚合酶I催化切除引物，剩下的DNA片段即冈崎片段补齐封口：DNA聚合酶I利用其DNA聚合酶活性按碱基互补原则沿5—3方向填补两个冈崎片段之间的缺口。其3末端羟基与下一个DNA片段5末端相连磷酸基，在DNA连结酶催化下形成磷酸二酯键而被连结起来，最终形成DNA模板链的完整新的互补链，此部由NAD+供能252627真核细胞与原核细胞DNA的复制区别RNA引物和冈崎片段较小复制速度较慢，这可能与组蛋白的存在使DNA处于稳定的双股状态有关复制有多个起点DNA聚合酶为α，β，γ以及线粒体聚合酶。它们仅能催化聚合作用，而没有原核细胞DNA聚合酶所有的外切酶作用DNA片段的连结由ATP供能真核细胞DNA的合成28真核细胞DNA聚合酶29fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacidArthurKornbergStanfordUniversityStanford,CA,USA1918-SeveroOchoaNewYorkUniversity,CollegeofMedicneNewYork,NY,USA1905-199330§1.2RNA指导下的DNA复制(逆转录)31RNA指导下的DNA复制(逆转录)以RNA指导的DNA聚合酶催化合成DNA是以dNTP为原料及能源物质，以病毒单链RNA为模板，RNA为引物反应时模板与引物以氢键相连，在引物3羟基末端开始以5—3方向进行DNA的聚合、延伸。合成的DNA以共价键相连，形成DNA-RNA杂合体。在DNA指导的DNA聚合酶催化下以杂合体中的DNA为模板合成一条DNA互补链，形成新的DNA分子逆转录酶是一种多功能酶具有合成RNA、合成DNA、水解RNA的能力32依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶RNA指导下的DNA复制(逆转录)33DavidBaltimoreMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)Cambridge,MA,USA1938-RenatoDulbeccoImperialCancerResearchFundLaboratory,London,UK1914-HowardMartinTeminUniversityofWisconsinMadison,WI,USA1934-1994fortheirdiscoveriesconcerningtheinteractionbetweentumourvirusesandthegeneticmaterialofthecell34§1.3DNA复制的忠实性DNA复制具有高度精确性，在大肠杆菌的细胞DNA复制中其错误率约为1/109～1/1010，即每109～1010个核苷酸才出现一个错误。这么高的精确性的保证主要与下列因素有关：碱基的配对规律：模板链与新生链之间的碱基配对保证碱基配错几率约为1/104～1/105DNA聚合酶的3→5外切酶活性的校对功能，使碱基的错配几率又降低100～1000倍DNA的损伤修复系统(错配修复、直接修复、切除修复、重组修复、易错修复)35DNA聚合酶的的自我校正DNA聚合酶不能从头合成DNA，即不能把两个dNTP连接起来，而只能将一个个核苷酸单位加到形成碱基配对的引物链3’羟基上，如果引物链3‘羟基出现了和模板链错配的碱基，DNA聚合酶就会立即停止前进，并利用35核酸外切酶活性将错配的核苷酸从引物3端切除，只有引物3端重新出现碱基配对时才继续合成DNA。所以在合成DNA之前必须有正确的碱基配对存在于3端，即DNA聚合酶必须利用RNA引物链来检验3端的碱基配对正确与否，在确认无误后才开始合成36错配校正系统错配校正系统能发现DNA双螺旋因非互补碱基对间的不对称而产生的变形，它能区分和切除存在于新合成的DNA中错配的核苷酸。E.coli的错配校正系统利用dam基因编码的甲基化酶将DNA碱基序列(GATC)中的A在N6位甲基化，但新合成的A要晚一些才被甲基化，这使碱基序列只是在刚合成的新DNA链中还没有被甲基化，这就能区别新DNA链和模板链参与错配修复的酶与蛋白质：Dam甲基化酶;MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;DNA聚合酶Ⅲ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶DNA连接酶；SSB37错配校正示意图38§2RNA生物合成的种类和方式DNA指导的RNA合成(转录)RNA指导的RNA合成(RNA复制)在生物界，RNA合成有两种方式：一是DNA指导的RNA合成，此为生物体内的主要合成方式。另一种是RNA指导的RNA合成，此种方式常见于病毒39§2.1DNA指导的RNA生物合成(转录)1.原核细胞RNA的生物合成2.真核细胞RNA的生物合成3.转录产物的加工40§2.1.1原核细胞RNA的生物合成1960年，RNA聚合酶被发现。在E.coli中，RNA聚合酶催化RNA的合成需要：模板：双链或单链DNA活性单体物质：四种NTP二价金属离子：Mg2+或Mn2+，在生物体中(invivo)发现的是Mg2+合成方向：5341转录不需要引物只转录DNA分子中的一个片段(称为操纵子operon)双链DNA中只有一条链具有转录活性(称为模板链)RNA聚合酶无校对功能RNA的合成与DNA合成的不同42复制和与转录的区别43DNA的有义链和反义链启动子(promoter)终止子(terminator)模板链（templattestrand）反义链(antisensestrand)有义链(sensestrand)非信息区DNA5´5´3´3´模板链：双链DNA中具有转录活性的的链称为模板链，又称反义链(或负链，Watson链)编码链：双链DNA中无转录活性的链称为编码链，又称有义链(或正链，Crick链)44DNA的有义链和反义链45E.Coli中的RNA聚合酶46E.Coli中的RNA聚合酶(亚基：转录的启动子识别)47真核生物中的RNA聚合酶48启动子和转录因子49终止子和终止因子50RNA转录的终止转录终止信号有两种：简单终止子(不依赖ρ因子)：(1)能形成发夹结构(2)在终止点之前具有一系列U核苷酸(连续6个)；回文对称区通常有一段富含GC序列依赖ρ因子的终止子：回文结构区不含富有GC区，回文结构之后也无寡聚U51不对称转录52转录时DNA双链局部解开53RNA转录过程RNA转录由识别、起始、延伸、终止四个阶段组成识别:RNA聚合酶在σ亚基的引导下结合于启动子；DNA双链局部解开，形成转录泡；起始：在模板链上通过碱基配对合成最初RNA链延伸：σ亚基脱离，核心酶沿着DNA链由3→5的方向移动，转录区间的DNA双链解螺旋，而转录完的区间DNA又恢复双螺旋结构终止：核心酶到达终止子，RNA与核心酶从DNA上脱落54RNA转录的起始55解螺旋恢复螺旋转录泡模板链编码链RNA聚合酶作用示意图56RNA转录的延伸57§2.1.2真核细胞RNA的生物合成真核生物的RNA聚合酶主要分布于细胞核内，RNA合成也就主要发生在细胞核中酶类分布产物α-鹅膏蕈碱对酶的影响分子量(KDa)反应条件ⅠⅡⅢ核仁核质核质rRNA（5.8S、18S、28S）mRNAtRNA、5SrRNA不抑制低浓度抑制高浓度抑制500～700～700低离子强度要求Mg2+或Mn2+高离子强度高Mn2+浓度58forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscriptionRogerD.KornbergStanfordUniversity,CA,USA1947-59罗杰科恩伯格(右)接受父亲阿瑟科恩伯格(左)的祝贺幼年时的罗杰科恩伯格(左一)和家人在一起60罗杰科恩伯格的贡献阐明了真核细胞转录的具体机理61§2.1.3RNA的转录后加工62原核生物的rRNA加工63原核生物的tRNA加工真核生物的tRNA加工与E.Coli相似64原核生物的mRNA加工65真核生物的rRNA加工66真核生物的mRNA加工67真核mRNA的5’-加帽68真核mRNA的3’-加尾69真核mRNA的剪辑(真核生物的结构基因通常是断裂的)70fortheirdiscoveriesofsplitgenesRi