天然药物青蒿素的合成及研究进展

天然药物青蒿素的合成及研究进展摘要：青蒿素是目前治疗疟疾的特效药。本文对自青蒿素发现以来的最新研究进展进行了比较详尽的综述。内容包括:青蒿素的发现及历史，青蒿素的来源，青蒿素的全合成，青蒿素的生物合成以及植物组织培养生产青蒿素，并对青蒿素生物合成的发展前景进行了展望。关键词：青蒿素全合成生物合成展望0.引言青蒿素（artemisine）是从中药青篙（菊科植物黄花蒿的地上部分干燥物）中提取的有过氧基团的倍半萜内酯抗疟新药，是我国发现的第一个被国际公认的天然药物，在其基础上合成了多种衍生物，如双氢青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素类药物毒性低、抗虐性强，被WTO批准为世界范围内治疗脑型疟疾和恶性疟疾的首选药物[1]。而疟疾是严重危害人类健康的疾病之一，据世界卫生组织（WHO）统计，目前世界上仍有90多个国家为疟疾流行区，全球每年发病人数达3亿～5亿，年死亡人数达100万～200万，其中80%以上的病例发生在非洲，因此对青蒿素的需求量逐年增加。但目前世界青蒿素药物生产主要依靠我国从天然青蒿中提取,产量受资源、环境和季节的限制，且生产成本高、产量低、难以满足市场需求。青蒿素虽已能人工合成,但成本高、难度大,也未能投入生产。因此，为增加青蒿素的资源，世界各国都在加紧开展青蒿素及其衍生物的开发研究,长期稳定地和大量地供应青蒿素成为各国科学家面临的严峻考验。近几年，人们试图通过化学合成和生物合成技术来解决青蒿素的生产问题。本文将对目前国际上青蒿素研究的现状从以下几个方面进行论述。1.青蒿素的发现及历史青蒿作为药物可以从2000年前，长沙马王堆出土的医书《五十二病》记载中发现，当时是用作治疗痔疮的。500年后，晋代葛洪《肘后备急方》记载，青蒿就用来进行抗疟治疗了，只不过以前都是把疟疾当成热病。医药经典著作《本草纲目》也作了同样的记述。我国对青蒿素的研究始于60年代中期，在周总理亲自批示下，先后组织60多个科研单位和500多员研究人员坚持不懈的深入研究，研究项目包括：新抗疟药物研治、驱蚊药物及措施等，其中包括从中草药中寻找新型药物及对其进行药效筛选。1973年，中国中医研究院中药研究所、山东省中医药研究所、云南省药物研究所分用乙醚、丙酮和石油醚从青蒿中提取到了抗疟有效成份青蒿素I。并于1976年通过化学反应、光谱数据和x射线单晶衍射方法证明其为一种含有过氧基的新型倍半萜内酯，分子式为cH：Os，其分子结构如下图所示[2]，其绝对构型由刘静明等通过旋光色散和氧原子的反常散射测定[3]。2.青蒿素的来源目前青蒿素的获得主要靠从青蒿中直接提取。青蒿虽在世界各地均有分布，但青蒿素的含量随产地的不同差别很大。除我国少数地区外，绝大多数地区生长的青蒿中青蒿素的含量都很低(≤1‰)［4］。在我国，青蒿中青蒿素的含量从南到北基本呈递减趋势。桂、黔、川青蒿资源丰富，青蒿素含量也较高，四川酉阳地区黄花蒿的青蒿素含量平均为0.8853%［5］。越南、印度等国家也有少量青蒿资源。青蒿中青蒿素含量偏低，提取成本高，导致青蒿素价格居高不下，难以满足市场需要。3.青蒿素的全合成青蒿素是具有过氧基团的新型倍半萜内酯，其分子式为C15H22O5，相对分子质量为282.33[5]。化学合成青蒿素这一复杂的天然分子是有机化学家所面临的挑战。Schmid[6]等1983年报道了一条应用关键化合物烯醇醚在低温下的光氧化反应引进过氧基的全合成路线，反应以(-)-2-异薄荷醇为原料，保留原料中的六元环，环上三条侧链烷基化，形成中间体，最后环合成含过氧桥的倍半萜内酯。1986年,徐杏祥[7]等人报道了青蒿素的全合成途径[8-10],其合成以R(+)-香草醛为原料,经十几步合成青蒿素,合成途径如图2所示。还有多种以不同原料为出发点进行青蒿素一类物的化学合成研究。1994年,Zhou和Xu[11]综述了国内外青蒿素全合成的研究进展。青蒿素全合成研究虽已取得一些明显的进展,但由于反应过程繁琐，反应过程中构型反转，副产物众多，原料昂贵等问题，使得全合成方法有成本高，难合成，产率低等缺点，到目前尚未显示出商业的可行性。3.青蒿素的组织的培养利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的另一热点,它为大规模生产青蒿素的提供了可能。目前在青篙芽、青篙毛状根和青篙发根农杆菌等培养体系中进行的青篙素合成技术极有可能被应用于工业生产。a.青蒿芽Ferreira等［12］在青蒿芽的培养过程中，检测到青蒿素的存在，并在诱导生根的青蒿芽中获得了高含量的青蒿素，约为干重的0.02%；改进培养基中的各种金属离子和复合维生素对芽中青蒿素的合成影响不明显，但添加赤霉素使得芽中青蒿素的含量提高了3～4倍。Woerdenbag等［13］在诱导的青蒿芽培养物中也检测到了青蒿素，并发现赤酶素和水解蛋白对芽中青蒿素的合成具有强刺激作用，为培植青蒿芽并提取青蒿素提供了依据。国内有耿飒、叶和春、张龙等［14-16］用不同发育阶段的的花蕾和花器官为外植体诱导丛生芽，并通过诱导丛生芽研究青蒿素生物合成相关因素，结果发现转基因青蒿中青蒿素含量相应提高。b.青蒿毛状根郭晨等［17,18］在硫化床生物反应器中培养青蒿毛状根取得了较好的效果，进一步探索不同培养方式以及生物反应器形式将为今后反应器的的商业化应用奠定基础。研究了不同温度（15～35℃）对青蒿毛状根生长和青蒿素生物合成的影响，发现25℃有利于毛状根生长，30℃促进了青蒿素生物合成。通过温度改变的二步培养技术（培养前20d温度控制在25℃，后10d温度提高到30℃），青蒿素的产量得到明显提高，高于在恒温培养时（25℃或30℃）的结果。刘春朝等［19］对影响青蒿毛状根生长及青蒿素合成的培养条件的如温度和光照等也进行了研究，发现在适宜光照、温度等条件下获得青蒿素的产量比原来有所提高。c.青蒿发根农杆菌培养研究发现发根与正常的未转化根是有差异的；发现离体培养的青蒿不定芽上发根对青蒿素生物合成有促进作用；天然生长的青蒿株根中不含青蒿素。因此，在大量培养发根生产青蒿素时，发根生长停止后就可以立即收获并提取青蒿素。蔡国琴等[20］用发根农杆菌转化药用植物青蒿并建立了发根体外培养系统，通过Southern杂交、NPTⅡ酶的检测证实了T-DNA转移并整合到植物的基因组上。刘本叶、叶和春等［21］从747条发根农杆菌ATCC15834转化的青蒿株系025发根中，筛选出7个生长较快的发根系，这7个系在生长速度和青蒿素含量上均有显著差异，其中发根系HR-9青蒿素收率最高，达到每月33.25mg／L。青蒿发根的生长量和青蒿素含量极显著高于未转化跟和愈伤组织。青蒿发根在分批培养中没有明显的迟滞期，接种后第7d进入指数生长期，第11d生长最快，第20d进入稳定期。青蒿发根中青蒿素含量呈明显的“与生长相关”特性，在指数生长期，青蒿素含量缓慢下降，生长速度减缓后，青蒿素含量上升，发根生长停止后，继续延长培养时间，青蒿素含量也不再提高。在分批培养中，青蒿发根适宜的培养时间为21d。d.青蒿素的生物反应器培养青蒿植物组织培养技术的应用，必须有较好的培养体系，有相应的培养设备才能实现工业生产。气升式反应器虽可改善培养基中氧传递，但长期浸泡易产生玻璃化现象，迄今尚无合理对策，只有解决了这个问题，才能实现工业化生产。Fulzele等［22］利用1L生物反应器进行青蒿芽的悬浮培养，经过30d的分批培养可获得再生的植株，生物量提高了4～5倍。Park等利用2L的长方形气提式生物反应器培养青蒿芽，经过4周的培养，培养物增殖8倍，获得的青蒿芽可长出不定根。刘春朝等［23,24］研究了适用于青蒿发根及芽培养的生物反应器及控技术，利用超声雾化生物反应器、自制流化床生物反应器、自制气升式内环流生物反应器进行青蒿毛状根多层培养生产青蒿素，在一定条件和工艺下，产量有所提高。雾化反应器中液体培养基生成雾滴还存在问题，且青蒿器官生长的表面液膜更新也较慢，所以目前离真正的工业化大生产还有一段距离，但科学工作者应该朝着这一方向去努力，以期能在提高青蒿素生物合成产量上有所作为。4.青蒿素的生物合成路线a.青蒿素前体生物合成青蒿素生物合成途径中的中间体的研究，是青蒿素生物合成代谢的重要途径。目前，已探测到与青蒿素生物合成有关的中间体有十几种左右，其中最为重要的为青蒿酸、青蒿素B、脱氢青蒿素、杜松烯等。实际上青蒿素合成途径是植物固醇合成的分支途径。汪猷等［25］在青蒿的匀浆中放入放射标记的青蒿酸，结果在青蒿素和青蒿素B中检测到放射性标记，认为在青蒿中由MVA合成青蒿素和青蒿素B的过程中，青蒿酸是一种重要的中间产物，并通过植物激素调节可以合成青蒿素的黄花蒿培养细胞中，缺乏青蒿素合成前体是青蒿素合成量低的重要原因。因而大力开展青蒿素合成前体的研究是提高青蒿素合成产量的关键。近年来，出现了以二氢青蒿素为原料的两种合成路线：二氢青蒿素与三氟乙酸酐反应制得三氟乙酰基二氢青蒿素，不经分离直接与酚类反应；二氢青蒿素与乙酸酐反应制得乙酰基二氢青蒿素后再与酚类反应。2003年，Abdin等［26］证明了青蒿酸是青蒿素合成的中间体，发现11，13－二氢青蒿酸26能转化为青蒿素。Martin等［27］用紫穗二烯合酶催化法呢基焦磷酸（FPP）环化制得了青蒿酸生物合成的前体紫穗二烯35.b.青蒿素生物合成青蒿素合成前体和中间体的大量研究为青蒿素合成生物途径提供了丰富的素材。近年来研究表明，青蒿素的生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径（图3）。植物类异戊二烯的生物合成至少存在2条途径，即甲羟戊酸途径(mevalonicacid，MVA)和丙酮酸/磷酸甘油醛途径(deoxyxylulose5-phosphate，DXP)。青蒿素等倍半萜类的生物合成途径属于MVA途径，该途径在细胞质中进行。根据目前离体转化、活体转化及同位素饲喂试验结果，青蒿素的生物合成途径可能包括2种方式，见图4、5。其中，第1种青蒿酸氧化途径可能为植物中青蒿素的主要生物合成途径。生物合成青蒿素的途径近年来引起了广泛关注，但目前的工作仅涉及合成青蒿素的生物合成中间体［28］，而青蒿素最终产品的研究进展不大，且鲜见报道。但这恰恰是可能提高青蒿素市场供给的最重要途径，因此要全面加大青蒿素最终产品生物合成的研究力度。图3植物类异戊二烯代谢途径图4图55.青蒿素生物合成关键酶及其基因调控a.3-羟基-3-甲基戊二酰GoA还原酶(HMGR)HMGR催化HMG-CoA形成甲羟戊酸(MVA)，由于MVA的形成是一个不可逆过程，故HMGR被视为MVA途径中的第1个关键酶，具限速作用。HMGR是萜类化合物代谢中的重要调控点，尤其是倍半萜类物质的合成，与HMGR活性呈正相关。Baldi等［29］研究了悬浮培养青蒿增加青蒿素产量的方法，通过增加所选的前体(甲基戊酸内酯)和诱导子(甲基茉莉花素)到最佳浓度，发展了整体增加青蒿素产量的策略，结果得到15.2μg/L生物量及110.2mg/L青蒿素，比对照组的产量高5.93倍。近年来研究表明，HMGR基因是一个三基因(hmg1，hmg2，hmg3)组成的基因家族。其基因家族成员的差异表达对MVA途径中萜类的生成起重要调控作用。应用3种马铃薯HMGR基因(hmg1，hmg2，hmg3)作为基因针，Choi等证明受伤诱导的固醇积累与HMGR1基因表达的诱导有关[30]。Yang等［31］对一些模式植物(如马铃薯)的研究结果表明，HMGRⅡ亚基因家族的成员表达与倍半萜类植保素的合成密切相关。b.法呢基焦磷酸合酶（FPPS）FPPS是一种1′，4-异戊二烯基转移酶，它催化IPP和DMAPP通过缩合作用形成GPP，GPP再与IPP缩合形成FPP［32-33］。IPP与DMAPP是植物中萜类合成的共同前体，在相关酶GPP合酶、FPP合酶、GGPP合酶的作用下，IPP与DMAPP头尾缩合生成线性前体GPP、FPP、GGPP。其中，FPP是倍半萜、三萜、多萜的共同前体。在质体中，GPP是单萜的前体，GGPP是二萜、四萜、叶绿醌等的前体。因此，要提高青蒿素的产量，提高FPP的量是至关重要的。提高FPP的