生化工程第二章

第二章培养基灭菌MediumSterilization生化工程学的起点1.抗杂菌污染的纯种培养技术(pureculture)：无菌空气、培养基灭菌(sterilization)、无污染接种、大型发酵罐的密封与抗污染设计制造。2.通气搅拌解决了液体深层培养时的供氧问题。建立关键技术：奠定生化工程学科基础。生物反应过程示意图目的：发酵过程要求纯培养灭菌(sterilization):培养基(medium)空气发酵罐及管道消毒(disinfection)生产环境灭菌与消毒的区别？第一节概述一灭菌方法二培养基及设备的灭菌（进罐后或进罐前灭菌）1.分批灭菌(batchsterilization)实罐灭菌(实消)：利用热空气或高压蒸汽对培养基与发酵罐同时灭菌。分批灭菌方法:预热－加热－冷却分批灭菌的特点：适用于：培养基易发泡或黏度大优点：操作简便，无需连消的设备，并减少了杂菌污染的机会缺点：升温降温时间长，设备利用率低2．连续灭菌(continuoussterilization)(连消)：培养基通过连续灭菌装置，快速连续加热灭菌，后进入灭菌的空罐。培养基时间与温度的变化关系连续培养下时间与温度的变化关系连续灭菌装置：1).连消塔保温罐连续灭菌2).板式热交换器连续灭菌3).蒸汽喷射连续灭菌连消塔保温罐连续灭菌板式热交换器连续灭菌适用于各类饮料及工业液体加热、杀菌、冷却、蒸发、冷凝和热回收等多种工艺过程蒸汽喷射连续灭菌分批灭菌与连续灭菌的特点3.空罐灭菌：空罐体灭菌罐压：1.5～2.0×105Pa；罐温：125～130℃，时间：30～45min4.发酵附属设备及管道灭菌：管道：罐压3.5×105Pa；时间：1～1.5h补料罐：糖水罐罐压1.5×105Pa；时间：30min消泡剂罐罐压：1.5～1.8×105Pa；时间：60min空气过滤器：罐压3.5×105Pa；蒸汽从上至下通入第二节加热灭菌的原理培养基灭菌要求：达到需要的无菌程度；有效成分受热破坏程度尽可能低。灭菌工作关键：控制加热温度（T）和受热时间(t)一、加热灭菌原理1、微生物的热阻：微生物对热的抵抗力称为热阻。（1）微生物对热的抵抗能力营养细胞：在60℃加热10min全部死亡；细菌芽孢：能耐较高的温度，在100℃需几分钟或几小时。嗜热菌的芽孢：120℃，39min或更长时间.（2）致死温度：杀死微生物的极限温度。（3）致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间。2、微生物的热死规律----对数残留定律热死亡动力学(一级反应动力学)规律：菌的死亡速率－dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比。即：－dN/dt＝KN(1)dN/dt：死亡速率，菌体瞬时变化率。N：残存活菌数，t：灭菌时间（min，s），K：比死亡速率常数或反应速率常数min－1，s－1将(1)式移项积分：ln(Ns/N0)=－Kt(2)可变形为：lnNs=－Kt+lnN0或Ns=N0e－Kt或t=1/K*ln(N0/Ns)N0：原有活菌数（t=0,污染度）Ns：经t时间后残存活菌数（灭菌度，Ns＝10－3）二K－比死亡速率常数（反应速率常数）1．K大小反映微生物受热死亡的难易程度。与微生物的种类及加热温度有关；相同温度下，k值愈小，加热时间长，则此微生物愈耐热。即：t=1/K*ln(N0/Ns)表14-7121℃某些细菌芽孢的k值细菌芽孢名称K值min-1枯草芽孢杆菌FS52303.8~2.6硬脂嗜热芽孢杆菌FS15180.77硬脂嗜热芽孢杆菌PA36792.9产气梭状芽孢杆菌1.8表14-8湿热灭菌杀灭细菌芽孢的温度和时间作者温度（℃）时间（min）作者温度（℃）时间（min）Sykes1302.4Eyre11515Sykes1256.4Novy11015Sykes12115Sykes11090Jorden1205Beeson11520Mur&Ritchie1207.5Sternbery11525Gerard115.510Sykes1001200Sykes11551•同一种微生物在不同灭菌温度下，灭菌温度愈低，k值愈；温度愈高，k值愈。t=1/K*ln(N0/Ns)K是温度T的函数，故T对K的影响是热灭菌设计的核心问题之一。2．温度T对K的影响T与K的关系，可用Arrhenius方程表示：K=Ae－ΔE/RTK：比死亡速率常数，也称反应速率常数（min－1或s－1）A：阿氏常数(s－1）E：活化能（J/mol）化学反应中，反应物分子到达活化分子所需的最小能量。活化能的大小与反应速率相关，活化能越低，反应速率越快，因此降低活化能会有效地促进反应的进行。T：绝对温度（K），T（K）＝t(℃)+273R：气体常数(8.31J/mol·K)e:2.718因：t=1/K*ln(N0/Ns)故：t=eΔE/RT*1/A*ln(N0/Ns)3．与K有关的表示方法：D（1/10衰减时间）decimalreactiontime：活微生物在受热过程中减少到原来数目的1/10所需要的时间。与K的关系为：D=－ln(0.1N0/N0)/K=－2.303lg0.1/K=2.303/K灭菌标准：以杀死耐热芽孢杆菌为准：ΔEs=68700cal/mol.k,As=7.94×1038(s-1)即:K=7.94×1038e-68700/1.98T三营养受热分解规律符合微生物热死亡动力学规律和Arrhenius方程：－dC/dt=K’C可变形为：ln(Cs/Co)=－K’t或Cs=C0e－K’tK’=Ae－ΔE’/RTK’：营养成分受热分解速率常数（min－1,s－1）ΔE：营养成分受热分解反应的活化能（J/mol）00lg1'ln'1CCtKCCKtss化学反应动力学：活化能大的反应，反应速度随温度的变化也大；反之，反应速度随温度的变化也小。注：微生物受热死亡的活化能ΔE比营养成分受热分解的活化能ΔE’大。ΔE大，说明反应速率随温度变化也大；当温度升高，微生物死亡速度比营养成分分解速度快。微生物活化能（J/mol）营养物活化能（J/mol）嗜热芽孢杆菌283460葡萄糖100488肉毒杆菌343300维生素B192114当温度升高，微生物死亡速度比营养成分分解速度快。故采取高温瞬时，有利于快速杀灭菌体，而且减少营养的破坏。例题：1.若温度从120℃升至150℃，分别计算120℃和150℃下的VB1的分解速率常数KB和嗜热芽孢杆菌的比死亡速率常数Ks；并比较KB150/KB120;Ks150/Ks120，反映何种规律。已知ΔEB1=92114J/mol,AB1=9.30×1010（min-1）;ΔEs=284460J/mol,As=1.34×1036(min-1)2.在120℃下灭菌7.6min，计算此时VC的损失率。(120℃下，若Kc＝0.055min－1)问题：为何工业上采用高温瞬时的灭菌方式？第三节分批灭菌培养基和发酵罐同时灭菌，冷却至发酵温度再接种发酵。又称间歇灭菌或实罐灭菌（实消）。分批灭菌的特点：适用于：培养基易发泡或黏度大优点：操作简便，无需连消的设备，并减少了杂菌污染的机会缺点：升温降温时间长，设备利用率低一灭菌效果(灭菌准数、灭菌值）当灭菌温度恒定下，培养基中微生物死亡遵循：lnN0/Ns=－kt当温度随时间变化时，K也变化：积分得ln(No/Ns)=A升温、维持和冷却过程的灭菌效果为：V总=ln(No/Ns)＝V加+V保＋V冷V加＝ln(No/N1)＝AV保＝ln(N1/N2)＝K（t2-t1）V冷＝ln(N2/Ns)＝A10/tRTEdte32/ttRTEdte10/tRTEdte二分批灭菌讨论工业灭菌，灭菌周期约3～5h,各阶段的灭菌贡献大致为：V加/V总=0.2,V保/V总=0.75,V冷/V总=0.053.某厂培养基初始杂菌数为106个/ml,生产要求最终无菌度为10-3。当发酵容器由1m3放大至10m3时，总灭菌效果增加多少。4.发酵培养基60m3，初始杂菌数为105个/ml,生产要求最终无菌度为10-3。采用分批灭菌方式，120℃维持5min.已知升温和降温的灭菌效果不超过总灭菌度效果的25％。则所设计的T-t过程是否达到无菌要求。如何改进。