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二代测序在遗传病检测方面的应用策略Bennett12/19/2019二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略二代测序简介遗传病简介目录二代测序简介NGS（Next-GenerationSequencing），下一代测序技术，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。样本准备samplefragmentation文库构建librarypreparation测序反应sequencingreaction数据分析dataanalysisSequelNextSeq500HiSeqXtenHiSeq2000/2500/4000MiseqNovaSeq特点：费用低、通量高、速度快二代测序简介将目标DNA打断为小片段单个小片段DNA分子结合到固相表面（微珠、芯片）单分子独立扩增（桥式PCR、乳液PCR）每次只复制一个碱基（A,C,T,G）并检测信号（荧光信号）高分辨率的成像系统二代测序基本原理：边合成边测序公司名称技术原理技术开发者商业模式ABI基于磁珠的大规模并行克隆连接DNA测序法美国Agencourt私人基因组学公司（APG）上市公司：销售设备和试剂获取利润Illumina合成测序法英国Solexa公司首席科学家DavidBentley上市公司：销售设备和试剂获取利润Roche大规模并行焦磷酸合成测序法美国454LifeSciences公司的创始人JonathanRothberg上市公司：销售设备和试剂获取利润，该产品已经于2013年停产。Helicos大规模并行单分子合成测序法美国斯坦福大学生物工程学家StephenQuake上市公司：2007年5月首次公开募股（IPO）（P.S.由于该平台准确率太低等原因，该公司已于2012年宣告破产）CompleteGenomicsDNA纳米阵列与组合探针锚定连接测序法美国CompleteGenomics公司首席科学家radojedrmanac私人公司：投资额为4650万美元，该公司于2013年被华大基因收购。主流测序平台一览：二代测序简介遗传病简介遗传病是指由遗传物质发生改变而引起的或者是由致病基因所控制的疾病。遗传病是指完全或部分由遗传因素决定的疾病，常为先天性的，也可后天发病。染色体病基因病器官（人体）人体由成千上万个细胞组成每个细胞核都含有23对染色体一对染色体分别来自父母每一条染色体都含有一条双链DNA分子，基因是具有功能的DNA片段双链DNA分子呈双螺旋结构遗传病简介染色体病：指由于染色体的数目或形态、结构异常引起的疾病：结构异常：猫叫综合症（5号染色体部分缺失）数目异常：常染色体：三体综合征性染色体：性腺发育不良（X0,XXY,XYY)遗传病简介染色体的结构变异染色体的数目变异基因病：单基因病常染色体:显性/隐性/不完全显性性染色体:伴X显性/伴X隐性/伴Y多基因病线粒体基因病遗传病简介人类共有序列有变异的序列正常点突变缺失插入重复10常染色体显性遗传病（AD）染色体隐性遗传病（AR）软骨发育不全、马凡氏综合征、多指和并指等白化病、苯丙酮尿症和先天聋哑等伴X染色体显性遗传病（XLD）抗维生素D佝偻病等伴X染色体隐性遗传病（XLR）血友病、色盲等伴Y染色体遗传外耳道多毛症等遗传病简介遗传病简介“一个人坏了一整锅王室基因”——维多利亚女王（英国）并没有整个欧洲，也就祸害了英国、西班牙、普鲁士和俄罗斯而已，法国和东欧得以幸免……有两个女儿带有血友病基因，一个儿子的血友病患者。第三个女儿艾丽斯嫁到德国，把血友病基因带给了黑森家族；艾丽斯的第二个女儿阿利克斯则嫁给了俄国沙皇尼古拉二世。小女儿比阿特丽斯嫁给了黑森大公爵路易斯二世的另一孙子，生下的女儿叫维多利亚，嫁给了西班牙国王阿方索13世。儿子利奥波德在31岁的时候因血友病死亡，生有一儿一女，女儿是血友病携带者目前遗传病有哪些检测手段？染色体核型分析技术（chromosomalkaryotypeanalysis）微阵列比较基因组（arrayCGH）多重连接探针扩增（MLPA）荧光原位杂交技术（FISH）串联质谱（TMS）高通量测序技术（NGS）二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略免疫组织化学法（IHC）二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略荧光原位杂交技术（FISH）多重连接探针扩增（MLPA）染色体核型分析技术（chromosomalkaryotypeanalysis）微阵列比较基因组（arrayCGH）串联质谱法（TMS）免疫组织化学法（IHC）染色体倍型、SNP、点突变、微缺失重复、染色体重排等的检测分析。物质的荷质比抗原抗体特异性结合原位杂交技术荧光标记技术氨基酸、有机酸、脂肪酸等代谢产物与代谢中间产物的检测。可检测：通过物理或化学方法可以获得基因序列可分析：通过生物信息可以解码基因携带的信息正常红细胞镰刀型贫血红细胞二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略二代测序技术在遗传病检测方面的应用基础：疾病目标基因集测序（genepanel）：目标区域捕获测序（targetsequencing）靶向捕获测序（Targetedcapturesequencing）定义：对基因组上某些疾病（或者某一类疾病）的目标致病基因进行捕获，并进行一次性检测。常用的目标序列捕获方法包括用设计好的探针与待测标本进行杂交捕获，或者通过PCR方式扩增目标DNA区域，然后将捕获或者扩增好的待测DNA序列进行测序。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略Genepanel的设计通常可以因研究目标不同而灵活设计：具有相似临床症状的一类疾病所涉及的目标基因根据不同的系统疾病所涉及的目标基因二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略癫痫SRPX2GABRB3GABRDCHRNA4MEF2CCHRNB2CACNA1DSYN1LGI1KCTD7KCNMA1……Aarskog-Scott综合征Aicardi-Goutieres综合症Alexander疾病Alpha-thalassemiaBainbridge-Ropers综合症Beckwith-Wiedemann综合征Borjeson-Forssman-Lehmann综合症Bosley-Salih-Alorainy综合症Brown-Vialetto-VanLaere综合征CAPOS综合征（弦枕综合症）CARASIL综合征CHARGE联合畸形Chudley-McCullough综合征Coffin-Lowry综合征Currarino综合症……60个左右的基因超过200种疾病二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略Genepanel策略的优点待测基因区域可以获得更好的测序深度与覆盖度，有助于检测出变异。在数据分析与解读方面，也更加有针对性，可以提高检测的准确性。Genepanel策略的局限性依赖与已知的基因序列与疾病的关联信息。对临床医生的要求比较高，要有丰富的临床经验。未来趋势：小而精，适用于明确的基因与疾病表型关系的情况。全外显子组测序（WES）：二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略全外显子组：人类基因组共30亿个碱基对，只有1~2%的DNA序列编码蛋白质，这些区域就叫外显子，基因组中全部外显子的集合就是外显子组。全外显子测序：Genepanel包含基因组上的全部蛋白编码区域，那么这个基因集就是外显子组了，对全外显子的捕获测序就是WES。目前，已知的约85%的疾病相关变异都发生在外显子区域。先证者全外显子组测序：存在“阴性”结果的风险。家系全外显子组测序：新发突变在数据过滤过程中不会去除，可以提高检出率，发现新的致病变异。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略全外显子组测序（WES）策略：先证者：指在对某个遗传性状进行家系调查时，其家系中第一个被确诊的那个人。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略全外显子组测序策略的优点可高效、无偏倚性的对个体的编码区变异进行检测。采用外显子组检测遗传病已经建立了比较成熟的流程。目前，是性价比较高的一种检测手段。全外显子组测序策略的局限性对CNV、SV等的变异检测涵盖不了。从大量的变异数据中发现致病变异需要对生信分析、数据解读和临床表型有更专业的认知。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略人类不同个体之间的基因组序列差异约为千分之一，每个外显子组测序会发现约20000~30000个变异，而真正的致病变异通常只有一两个。因此对致病变异进行过滤分析变得尤为重要，目前使用的这些方法都不能保证100%准确，只是对变异进行优先级排序，最后得到的是优先级最高的变异集合。在实际工作中需要结合临床情况验证。全外显子测序检测流程：二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略Rett综合征：运动发育迟缓、病毒感染、缺氧缺血性脑病Floating-Harbor综合征：出生发育落后，说话不清楚，不和人主动说话，妈妈精神异常。案例分享：二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略全基因组测序（WGS）：二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略定义：即对人的基因组中的全部基因进行测序，测定其DNA的碱基序列。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略WGS测序分析流程能分为三大块，数据处理、检测变异和综合分析，具体如下图所示：样本准备样本寄送收样系统信息填写，打印样本信息单收样组收样样本信息单与实际到样核对，到样信息与系统信息核对蓝冰或者协商低温送样流入生产环节收样组收样收样环节样本质检提取核酸质检/文库质检建库生产平台提取建库数据下机，分路径上机平台上机测序生产环节硬盘交付/云盘交付二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略覆盖面广，能检测个体基因组中的全部遗传信息。准确性高，其准确率可高达99.99%。可检测出单核苷酸变异(SNVs)、插入缺失(InDels)、拷贝数变异(CNV)和结构变异(SV)等多种全面的变异信息。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略全基因组测序策略的优点全基因组测序策略的局限性全基因组测序成本更高。涉及大量的非编码序列，信息量大、分析复杂。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略案例分享：（常染色体隐性遗传，发现一个CAPN3点突变）22岁王小姐，从小运动能力较同龄人差，10岁时出现腿痛，13岁时发现跟腱挛缩，上楼费力，医院检查发现双侧臀部及大腿肌肉弥漫信号改变。（肢带型肌营养不良）CAPN3基因上发现错义突变和染色体微缺失两种变异：罕见的错义突变来自母亲，一个6.7kb的微缺失，覆盖基因的4个外显子来自父亲，符合常染色体隐性遗传模式，结合张小姐的临床诊断和相关基因检测结果，基本上可以确诊为CAPN3突变引起的肢帯型肌营养不良2A型。二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略案例分享：连续5胎脑积水之谜X连锁L1CAM同义突变产生新的剪接位点新的mRNA缺少24个碱基功能丧失的蛋白李小姐之前有过四次妊娠，每次到了妊娠中后期，不得不面对一个残酷的现实——胎儿被检查出有脑积水。就诊时，李小姐已经是第五次怀孕的第25周——这意味着她已经连续四次，不得不放弃腹中的孩子。可是这一次的B超提示，第五胎仍为脑积水儿。医生们对第五胎进行脐血穿刺、胎儿染色体及基因芯片检测后，都没有阳性发现。筛选到了一个与脑积水密切关联的X连锁L1CAM基因的突变位点除了男性胎儿有该突变位点外，李小姐同样携带该位点，但这是X连锁隐性遗传，携带这个突变位点的女性不会患病，但可以传递给男性后代，导致其患病。案例分享：尚未查明原因的疾病二代测序技术在遗传病检测方面的应用策略JohenEdwards出生后不久，肌肉就开始变得松软；从两岁半开始，Johen逐渐丧失语言能力，现在的他只能说少量的词汇并且大多含混不清。普拉德-威（Prader-Willisyndrome）综合征？？？……疑似的遗传性疾病都被排除掉了。全外显子组测序并没有给出Edwards夫妇想要的诊断结果。比对分析Johen的全外显子组测序和全基因组测序结果找到了一些变异，但就目前的医疗成果来看，这些变异不太可能会造成Johen的疾病。——全基因组测序并