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食蟹猴人工授精及體外受精實驗初步程序KHIBioservices(HongKong)Limited袁濤D.V.M1人工授精及體外受精實驗初步程序:1人工授精(artificialinsemination)1.1母猴準備利用獨立籠檢視母猴月經,選擇有正常及規律性月經之猴子進行利用腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)檢查卵巢及卵泡發育情況,自月經後第5天每隔一天檢查,接近排卵期時每天進行檢查,直至確定排卵.[另有學者進行荷爾蒙測試(estrogen,progesterone,LH)確定排卵(estrogen,↓progesterone,LH),↑↑腹腔鏡(Laparoscopy)或超聲波(Ultrasound)較能直接檢視卵泡發育狀況]1.2公猴取樣-電激棒取樣一般分有penilestimulation及rectalprobestimulation電激棒之規格HzV(電壓)I(電流)持續時間間隔18-2010-15(DC)建議100-200mA(參考其他禽畜)3-5s5-10s-精子處理方法1取樣後,凝固精液放於37C30分鍾5%CO2培育箱液化2液態精液以Tyrodealbuminlactatepyruate-HEPES(TALP-HEPES)稀釋1:53抽取小許檢視精子活力,形態及數量4稀釋至2.0–4.0x108精子/ml[另有日本研究用2.5–5.0x107精子/ml濃度進行授精]5培育於30–32,2-3小時[另有加入1mMCaffeine使精子活能化(capacitation)]1.3授精程序有文獻提及,日本獼猴人工授精實驗中,授精於陰道內之猴不能授精,而只有授精於子官內方可成功.於食蟹猴陰道及子官均可.1當母猴証實排卵時,每天進行0.2ml輸精,一般由11-14天2麻醉母猴3利用1ml針筒及老鼠餵管或人工授精導管進行子官內輸送精子4另外手指進入直腸確定子官頸及子官位置,協助引導管道進入子官,伸入管道於母猴陰道及子官頸,管道輕輕引導進入子官內.5如進入子官頸有困難,可利用擴張器擴大陰道,然後繼續找尋6導管進到子官內,慢慢注射-懷孕檢測程序1Progesterone測試1progesterone於最近之月經30天後進行測試.[月經後30天Progesterone應該降低,如升高代表懷孕]2超聲波Ultrasound測試於50-60天可進行超聲波Ultrasound測試1.4冷凍精液-程序方法培養液製法Tris-basemedium:300mMTris.28mMglucose,95mMcritricacid,5%(v/v)glycerol,1000IU/mlgentamicin,1mg/mlstreptomycin,20%(v/v)chickeneggyolk.1取樣後,固態精液放於37C30分鍾液化2液態精液以Tris-basedmedium稀釋5倍3稀釋精液慢慢冷凍至5C在90-120分鐘內於4C雪櫃4精液以200ul分裝,以乾冰冷凍60–90s,貯存於liquidnitrogen,-196C5於IVF或AI前,試管內冰凍顆粒於37C水箱搖動45-60s解凍6解凍精液供IVF以TALP稀釋至20x10^6精子/ml,精液用於人工授精則不用稀釋,直接採用.2試管受精(Invitrofertilization)2.1超排(Superovulation)-藥物注射程序方法1一般超數排卵方法是給予促性激素(FSH,LH,HCG,eCG)於不同時期注射,引致卵巢超數排卵,但注射激素同時易引起排出未成熟卵子,一般在程序上加入GnRH/GnRHantagonist(拮抗劑)注射1至數天,作用防止卵子未有成熟發育,1月經開始後,替母猴皮下注射0.75–3.75mgGnRH2在第10天至14天時,以腹腔鏡確定沒有卵胞發育3肌肉注射9天eCG(孕馬血清)25IU/kg/天4在第5天開始注射eCG後,每隔一天利用腹腔鏡檢查卵胞發育程度5在9天注射eCG後,卵泡上的白皮質(tunicaalbugineaofthefollicle)開始變薄及透明,卵胞發育足夠成熟後,注射400IU/kghCG方法21月經開始後,替母猴皮下注射6天0.5mg/kgGnRHantagonist(Antide)2在此段時間,同時注射rhFSH,每天兩次(30IU)3注射1-3天rhFSH及rhLH（各30IU）每天兩次4在第7天進行超聲波檢視卵泡生長情況5當卵泡3-4mm,注射1000IUhCG627小時後,收集卵母細胞2.2收集卵胞117–41(27-32小時forRhesusmonkey)小時注射hCG後,以3ml針筒加有18或19號針(70mm長)抽取0.2mlTyrodealbuminlactatepyruate-HEPES(TALP-HEPES)2在腹腔鏡檢視下,以針頭插入及抽取成熟卵母細胞(oocyte),抽掉卵泡及其液體3用顯微鏡檢視成熟卵母細胞,有cumuluscell為MetaphaseII(MII)[Germinalvesicle,MetaphaseIeggs未夠成熟,需人工培養方可進行試管受精,只有MIIegg適合受精]4於37C5%CO2培育3-4小時5成熟卵母細胞準備試管受精2.3精子準備方法11取樣後,凝固精液放於37C30分鍾5%CO2培育箱液化2液態精液以2mlBWW-0.3%BSA稀釋3加80%Percoll於試管內,然後在上面加入60%Percoll,最後加入精子4離心20分鍾,1300rpm5抽取BWW-0.3%BSA層,60%percoll及80%percoll,留下底部精液部份6加入5-10mlBWW/BSA,離心清洗3分鍾,1300rpm7加入10mlBWW/BSA含有1mM咖啡因(Caffeine)及1mMdibutyrylcyclicAMP於管內,培育於37C30分鍾,使精子活能化(capacitation)8離心1000rpm,2分鐘9倒去液體部份,加入0.5ml至1.0ml培育60分鐘10抽取游離液體面之精子,移到另一枝管子11檢視動力(Motility)及數目(Count)12加入BWW/BSA,稀釋至1.0–2.0x105精子/ml方法21取樣後,凝固精液放於37C30分鍾5%CO2培育箱液化2液態精液以2mlTyrodealbuminlactatepyruate-HEPES(TALP-HEPES)稀釋3離心清洗2次,每次8分鍾,1300rpm4培育於37C,4-5小時,5%CO25離心8分鍾,1300rpm6加入10mlTALP-HEPES含有1mM咖啡因(Caffeine)及1mMdibutyrylcyclicAMP於管內,培育於37C15分鍾,使精子活能化(capacitation)2.4試管培養(Invitrofertilization)11至5個成熟卵母細胞(oocyte)及cumuluscells放入100ulTALP-HEPES培養液2加上礦物油蓋面3加入100ul稀釋精液4培育於37C5%CO2培育箱515–16小時後,若出現2個pronuclei,卵母細胞成受精6受精卵母細胞清洗及更換培養液736至66個小時,2至8個細胞之胚胎選擇進行胚胎移植3胚胎移植(Embryotransfer)胚胎移殖方法有不同,有提及利用腹腔鏡或超聲波引導下進行,另有剖腹手術(laparotomy),傳送卵子到輸卵管.3.1受體選擇1選擇母猴有正常月經2於胚胎移植前2-3天排卵之母猴選擇為受體3胚胎應移入含有黃體之子官輸卵管內3.2胚胎移植程序11至2個胚胎混和於10ulTALP-HEPES培養液在胚胎移植之導管內2胚胎移植導管利用平時腹腔鏡插管位插入腹部.3導管尖移到接近繖(fimbria)及套入輸卵管(oviducalorificinthefimbria)4導管尖部插入輸卵管內部15-20mm,注入胚胎.