基因诊断(5)

目录基因诊断GeneDiagnosis目录目录第一节基因诊断学基础第二节感染性疾病的基因诊断第三节遗传病的基因诊断第四节复杂性疾病的基因诊断（肿瘤）内容提要目录目录第一节基因诊断学基础BasisofGeneDiagnostics目录目录基因诊断之父—简悦威1976年加州大学华裔科学家KanYW用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫血进行诊断。目录目录一、基因诊断的概念、特点及临床意义定义：利用分子生物学技术，检测基因及基因表达产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因诊断检测的目标分子DNARNA蛋白质或者多肽。基因疾病目录目录诊断依据(遗传物质改变)DNA、RNA或蛋白质水平变化，病毒基因及其转录产物在体内从无到有感染性疾病疾病遗传性疾病复杂性疾病外伤基因结构变化，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活癌基因表达水平从低到高；目录目录基因诊断的特点高特异性高灵敏性早期诊断性应用广泛性目录目录二、基因诊断中常用的分子生物学技术核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（DNAsequencing）生物芯片（biochips）Western免疫印迹（Westernblotting）免疫组织化学诊断目录目录基因诊断中常用的分子生物学方法比较方法优点与问题解决方案核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐选择合适的探针PCR灵敏度、特异性高设计合适的引物SSCP操作简便、检出率不高选择合适的片段RFLP结果可靠但限制较多选择合适的限制酶DNA测序可自动化，但不适宜广泛使用与PCR配合使用生物芯片效率高，成本高，不适宜广泛使用选择合适的芯片目录目录一、总论二、病毒的基因检测三、病原菌的基因检测第二节感染性疾病的基因诊断目录目录（一）、感染性疾病分子诊断的策略1.一般性检出策略2.完全检出策略一、感染病基因诊断的总论目录目录1.一般性检出策略和方法感染性疾病分子诊断一般性检出策略：针对特异性的核酸序列进行核酸分子探针杂交，或者利用常规PCR技术直接检出微生物的DNA/RNA，它能够判断有无感染和是何种病原体感染。目录目录2.完整检出策略和方法感染性疾病分子诊断完整检出策略：通过分子杂交结合PCR技术、特殊PCR技术和芯片技术、核酸测序技术的运用，对大多数感染性病原体作出明确判断，而且能够诊断出带菌者和潜在性感染，并能对病原体进行分类、分型（亚型）和耐药性鉴定。目录目录二、感染病疾病分子诊断的常用方法1.信号放大技术检测方法采用多酶、多探针或二者结合等方式来增加探针标记物的浓度使检测信号得到放大，从而提高检测的灵敏度。优点：稳定性、重复性及特异性都较高，结果准确，不存在可能污染的问题。缺点：灵敏度较低，不适用于微量病原微生物的分子检测。目录目录常见的几种方法液相杂交法杂交捕获法支链DNA技术目录目录2．靶分子扩增技术检测方法（1）以PCR为基础的扩增方法（2）替代的扩增方法（3）探针扩增系统优点：简便、快速、灵敏度高缺点：易由于背景污染、扩增产物污染导致假阳性结果目录目录(三)感染疾病分子诊断的标本处理1．标本的选择主要取决于相关疾病的临床表现、感染的病理学机制。2．标本量及抗凝剂标本量要求少，但不同方法所需标本量可能不同。肝素不适于分子检测标本的抗凝。3．标本的传送、保存比较灵活，传送过程避免污染，一般保存于-80℃。4．标本的预处理包括核酸的提取，另外还包括扩增抑制物的去除及潜在危险病原体的灭活。目录目录(四)感染病疾病分子诊断的结果解释1．阴性结果注意检测灵敏度、核酸提取及扩增效率。2．阳性结果需考虑检测方法本身的特异性和可能受到的污染。3．定性检测结果定性分子检测结果并不能提供有关病原体活力的相关信息。4．疾病状况的判断核酸存在不一定代表患病目录目录(五)感染疾病分子诊断的临床应用及评价1、应用弥补血清学检测技术的缺陷检测不能培养或生长缓慢的病原微生物通过病原微生物的定量检测监测疾病微生物耐药性的检测细菌分型及流行病学调查目录目录2、评价优点：（1）简便、快速且灵敏度和特异性都较高（2）适用于一些疾病的早期诊断、确诊性诊断及爆发性感染的大规模检测。缺点：与其它结果不相符应用原则：注意将分子检测结果结合临床特别是患者病史及、综合考虑体检、X片CT及其它各种检测结果，以便准确判断病情。目录目录二、病毒的基因检测（一）HBV（二）HCV（三）HPV（四）HIV（五）HSV（六）CMV目录目录（一）乙型肝炎病毒BaruchSamuelBlumberg1976年诺贝尔奖目录目录1.病毒基因组结构S表面蛋白P聚合酶C核心蛋白X转录蛋白目录目录2.分子诊断方法（1）信号放大技术支链DNA技术（bDNA）2×105拷贝/ml，不太适用于低浓度检测。range(2,000to109copies/mL)Simens目录目录（2）液相杂交检测125I标记核酸探针，与变性DNA杂交。γ闪烁计数仪定量检测标记的探针。灵敏度为106拷贝/ml。目录目录（3）杂交捕获系统信号放大3000倍。灵敏度为4700拷贝/ml。dioxetaneReleaseNucleicAcidsHybridiseRNAProbecaptureLabelforDetectionDetect,readAPFDA批准目录目录（4）PCR法1）定性S、C、P和X基因中的高度保守序列2）定量实时定量PCR技术（最灵敏的方法）TaqMan探针TaqMan-MGB探针能够检测少至10拷贝/mL的HBVDNA目录目录HBV定量HBV病毒定量目录目录3．耐药性检测（1）P基因，YMDDYVDD、YIDD）。（2）HBV-DNA前C区基因突变。荧光定量（Tm曲线）ATGGTGATTPCR-RFLPDHPLC荧光定量（三探针）测序目录目录1、HBV感染的早期诊断2、监测治疗效果3、判断病情，指导制订合理的治疗方案（三）临床意义目录目录二、丙型肝炎病毒目录目录HCV的RNA定性和定量分析方法：RT-PCR，TMA，bDNA，逆向杂交多列探针检测法reversehybridizationbasedlineprobeassay，INNO-LIPA直接测序HCV的分子检测方法目录目录表临床应用的HCVRNA检测试剂盒检测试剂盒检测方法评价AmplicorHCVTestv2.0RT-PCR定量检测，检测下限50IU/mlVersantHCVRNAAssayTMA定量检测，检测下限5IU/mlIn-LaboratoryDevlepoedVersantHCVRNAv3.0AssayRT-PCRbDNA定性检测定量检测，检测限为615~7.7百万IU/mlAmplicorHCVMonitorTestv2.0RT-PCR定量检测，检测限为600~8十万IU/mlLaboratoryDevlepoedTestRT-PCR定性、定量检测Real-TimeHCVAssay(ASR)RT-PCR定量检测，检测限为10-50IU/ml~10-30百万IU/ml目录目录三、人类乳头瘤病毒（HPV）（一）病毒基因组结构HPV16NCRE6E7E1bE4E2E5L2L17904.1E1aHPV16基因组结构模式图E1-E7（早期基因）：控制病毒的复制和转化功能L1L2（晚期基因）：编码病毒的衣壳蛋白NCR（非编码区）目录目录（二）HPV的分子检测方法1、杂交捕获检测法(FDA批准)该检测方法只能作出危险度判断，并不能确定HPV的具体型别。对于高危险性HPV的检测会出现假阳性的结果，可能是由于高危险性HPV探针同低危险性HPV的非特异性结合，这种情况多出现在检测高浓度的HPV6或者HPV42DNA样本时。目录目录2、核酸扩增法FQ-PCR、竞争性PCR杂交PCR。芯片目录目录表人乳头状病毒基因检测常用的引物扩增位置引物序列扩增片段大小(bp)通用引物5’-CGTCCAAGAGGAAACTGATC-3’5’-GCACAGGGACATAATAATGG-3’450HPV16型5’-TTTTGGGTTACACATTTACAAG-3’5’-TGTCTGCTTTTATACTAACCG-3’119HPV18型5’-GACACCTTAATGAAAAACGACGA-3’5’-CGTCGTTGGAGTCGTTCCTG-3’103HPV6型5’-TAGTGGGCCTATGGCTCGTC-3’5’-TCCATTAGCCTCCACGGGTG-3’280HPV11型5’-GGAATACATGCGCCATGTGC-3’5’-CGAGCACGACGTCCGTCCTCG-3’360HPV33型5’-ATGATAGATGATGTAACGCC-3’5’-GCACACTCCATGCGTATCAG-3’455目录目录四、人类免疫缺陷病毒目录目录目录目录HIV发现者2008诺贝尔奖医学或生理学目录目录LTRgagvifenvLTRpolvprneftatrevHIV-2LTRgagvifenvLTRpolvprnefvputatrevvpx基因组示意图LTR：长端重复序列（包含启动子、增强子及TATA序列等）gag基因：编码P55蛋白前体pol基因：编码逆转录酶、蛋白水解酶及整合酶env基因：编码包膜前体蛋白结构基因：调控基因：rev基因：编码一种转录后反式激活因子tat基因：编码一种反式激活转录因子nef基因：编码负调节蛋白vif基因：编码病毒感染因子vpu基因：编码产物与病毒的装配、成熟和释放有关vpr基因：编码一种弱转录激活因子目录目录基本情况2类型（1，2）三群：主群，局外群，新群10亚型：M群中，A-J，以ENV基因分型目录目录（二）分子诊断方法蛋白水平检测初筛：ELISA，免疫荧光试验确证：WesternBlotp24,gp120目录目录1、病毒量检测（1）RT-PCR这是目前国内外采用较多的一种检测方法，该能对HIV-1的A到H亚型病毒进行准确地定量测定。核酸水平检测目录目录靶序列引物和探针序列扩增片段长度（bp）LTR引物5’-ACTAGGGAACCCACTGCT-3’5’-GGTCTGAGGGATCTCTA-3’探针5’-ACCAGAGTCACACAACAGACGGGCACACACTACT-3’105gag引物5’-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3’5’-TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC-3’探针5’-ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC-3’115pol引物5’-TGGGAAGTTCAATTAGGAATACCAC-3’5’-CCTACTATACAAATCATCCATGTATTC-3’探针5’-ATGAGACACCAGGGATTAGATATCAGTACAATGTGCT-3’308表PCR检测HIV中部分常用的引物和探针注意，ENV基因不用作靶基因*目录目录（2）其它常用检测方法FDA认可的HIV-1病毒量检测法试剂盒名称扩增方法可报告范围AmplicorHIVMonitorv1.5TestROCHERT-PCR超灵敏：50－100,000c/mL标准：400－750,000c/mLVersantHIVRNA3.0Assay(BAYER)bDNA75－500,000c/mLNuclisensHIV-1Q7AssayBiomerieuxNASBA176-3,470,000c/mL目录目录（1）HIV病毒表型的检测测序（最广泛）高密度DNA微阵列检测法逆向杂交多列探针检测法。检测出“逆转录酶”和“蛋白酶”基因突变。2、病毒表型和耐药性检测目录目录（2）HIV病毒表型的耐药性检测1）虚拟表现型技术（PhenoSenseassay）目录目录2）抗病毒图形检测技术（Antivirogram）