梅毒的实验室检测与临床应用

梅毒的实验室检测与临床应用欧蒙医学诊断张嘉华技术支持工程师2梅毒Syphilis血清学检测方法血清学检测的临床意义梅毒检测策略梅毒简介•20世纪80年代，梅毒在我国重新出现，90年代末以来，全国梅毒报告病例数明显增加，流行呈现快速上升趋势。背景年份全国病例数年发病率1999804066.50/10万200932743324.66/10万201343534631.09/10万*数据来源于卫生部公布的全国法定传染病疫情全国梅毒流行状况051015202530351995199619971998199920002001200220032004200520062007200820092010年份发病率(1/10万)全部梅毒一期梅毒二期梅毒4梅毒发病率呈逐年上升的趋势梅毒感染的预防、诊断、监测等一直是卫生部性病传染病工作的要点2013年，梅毒报告病例数在我国甲乙类传染病报告中居第三位，而且高危人群梅毒感染率高。高危人群阳性率分类全国最高梅毒抗体阳性率全国平均梅毒抗体阳性率暗娼人群30.6%2.4%男男性行为人群31.2%9.1%吸毒人群27.9%3.4%孕产妇人群11.3%0.5%*数据来源于卫生部公布的中国预防与控制梅毒规划（2010-2020年）梅毒简介•由梅毒螺旋体感染人体所引起的慢性传染病–病原体：苍白密螺旋体（treponemapallidum，TP）–只感染人类，人是梅毒的唯一传染源•几乎可侵犯全身各个器官–皮肤/粘膜–心血管系统–中枢神经系统•2013年度全国传染病疫情调查显示：–梅毒发病数居乙类传染病的第三位–仅次于病毒性肝炎、肺结核•传染途径：–性接触–输血传染–间接传染–胎盘传播•梅毒分期：–早期梅毒(感染时间2年)：一期、二期–晚期梅毒(感染时间2年)：三期先天梅毒后天梅毒（获得性）梅毒简介梅毒分期感染硬下疳全身症状(皮肤/粘膜)皮肤/粘膜/心血管/神经病程平均3周3-8周2-3月一期潜伏一期二期三期二期潜伏三期潜伏早期梅毒(病程2年)晚期梅毒(病程2年)3-12月梅毒感染患者不同时期抗体反应性•两种抗体：–非特异性梅毒抗体•反应素（Reagin）–未经治疗可长期存在；–治疗后逐渐减少至阴性。–特异性梅毒抗体•IgG–二期达到峰值–一经产生终生存在•IgM–有感染而出现–随感染消失而消失ModifiedfromPeelingRW,2004梅毒血清学检测方法非梅毒螺旋体抗原血清学试验–抗原：梅毒螺旋体表面释放的类脂质–抗体：抗类脂抗原的抗体（反应素）–抗原：梅毒螺旋体–抗体：梅毒特异性抗体梅毒螺旋体抗原血清学试验梅毒血清学检测方法梅毒螺旋体抗原血清学试验非梅毒螺旋体抗原血清学试验非梅毒螺旋体抗原血清学试验12性病研究实验室试验VenerealdiseaseresearchlaboratorytestVDRL不加热血清反应素试验UnheatedserumreactionUSR快速血浆反应素环状卡片试验RapidplasmareaginRPR甲苯胺红不加热血清试验ToluidineredunheatedserumtestTRUST四种检测方法一个基本原理非梅毒螺旋体抗原血清学试验：基本原理抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见抗原基本成分：心磷脂、卵磷脂、胆固醇检测成分：血清梅毒反应素13基本原理示意图一个基本原理非梅毒螺旋体抗原血清学试验：实验操作14定性试验定量试验加血清加抗原水平螺旋仪反应观察结果倍比稀释通过观察不同稀释度的血清发生凝集反应的特征，对血清中的抗体浓度进行半定量。非梅毒螺旋体抗原血清学试验：结果示意15VDRLTRUSTRPR图片来源：网络定性定量定性定性方法：凝集块的大小、形态、分布等特征用“+/-”符号表示。定量方法：滴度：出现肉眼可见的凝集反应的血清最高稀释倍数。非梅毒螺旋体抗原血清试验VDRLRPRTRUST抗原相同相同相同试剂现配不需现配不需现配样品灭活不需灭活不需灭活样品/抗原量指示剂50/17ul无50/17ul碳粒50/17ul甲苯胺红转速180±5/m100±5/m100±5/m时间4分钟8分钟8分钟观察显微镜肉眼肉眼温度23~29℃23~29℃23~29℃反应板直径14mm18mm18mm应用CSF、血清血清、血浆血清、血浆非梅毒螺旋体抗原血清学试验：检测方法17四种检测方法VDRLUSRRPRTRUST抗原试剂含EDTA×√√√抗原试剂含氯化胆碱×√√√是否有成品试剂盒×√√√载体(玻片)(玻片)(白色硬纸片)(白色硬纸片)结果肉眼是否可见××√√沉淀指示物××√(黑色碳颗粒)√(甲苯胺红)可否定量××√√敏感性和特异性基本相似非梅毒螺旋体抗原血清学试验•假阳性：–技术性假阳性：标本保存、试剂质量、实验室操作等–生物学假阳性：•患者有其他疾病或生理状态变化，使梅毒血清试验出现阳性–SLE、麻风、妊娠、麻醉剂依赖等多种疾病和生理表现•需用特异性抗体检测进一步证实18孕妇的生物学假阳性特异性抗体IgM检测可以为梅毒活动性检测和治疗检测提供补充资料，尤其在非特异性抗体阴性，和治疗后非特异性抗体持续阳性的情况下。•假阴性：–25%-40%的未治梅毒在晚期隐性期可自然逆转为阴性–约30%的心血管和神经梅毒呈阴性–前带现象：•梅毒非特异性试验中，抗体浓度过高导致的阴性结果，继续稀释血清做试验•可发生于梅毒各期，特别是一、二期•妊娠、神经梅毒、性别、年龄、患者治疗与否与RPR前带现象相关•不仅发生于高滴度患者，也发生于中低度患者•大约31%发生前带现象的患者RPR滴度≤1：16•前带现象发生率0.83%来自于厦门大学附属中山医院统计非梅毒螺旋体抗原血清学试验•血清固定：–梅毒患者经过正规治疗和充分的随访（2年以上），非梅毒螺旋体抗原血清试验仍不阴转•一期梅毒随访1年•二期梅毒随访2年•晚期梅毒随访3年22非梅毒螺旋体抗原血清试验临床意义•非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。•未经治疗一期梅毒敏感性72-99%，二期88-100%，晚期34-94%，特异性93-99%。•因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。•VDRL试验用于神经梅毒脑脊液检测特异性高，检测阳性可以作为神经梅毒确诊依据，但敏感性较低，即检测阴性不能排除神经梅毒。23总结非梅毒螺旋体抗原血清学试验优点：价格低廉操作方便适用于初筛缺点：假阳性较高特异性较差2425梅毒螺旋体抗原血清学试验非梅毒螺旋体抗原血清学试验非梅毒螺旋体抗原血清学试验梅毒螺旋体抗原血清学试验荧光螺旋体抗体吸收试验FluorescenttreponemalantibodyabsorptiontestFTA-ABS梅毒螺旋体颗粒/血球凝集试验T.pallidumparticle/haemagglutinationassayTPPATPHA梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验Enzyme-linkedimmunosorbentassayTP-ELISA梅毒免疫层析法-梅毒快速检测TP-RT化学发光免疫分析法chemiluminescenceimmunoassayCLIA梅毒螺旋体蛋白印迹试验WesternblotWBFTA-ABS•检测梅毒的“金标准”•抗原：密螺旋体无毒株（Nichols株）•荧光显微镜下，螺旋体显出苹果绿色的荧光，即为阳性反应•技术要求高、需要荧光显微镜27完整梅毒螺旋体抗原患者血清(含抗体)荧光标记的抗人免疫球蛋白荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）梅毒确认试剂28欧蒙FTA-ABS•IIF：FTA-ABS分别检测IgM和IgG抗体预先通过FAT吸附剂处理（超声裂解的溃蚀密螺旋体）去除样本中抗相似抗原的抗体通过梅毒螺旋体/溃蚀密螺旋体生物薄片的组合判断其它螺旋体抗体吸附是否成功29欧蒙梅毒荧光判读原则荧光模式（阳性反应）：荧光显微镜下，梅毒螺旋体显出苹果绿色的荧光。注意：每个反应区中的螺旋体都必须清晰可辨，如果只有几个虫体出现荧光，则不考虑。应尽可能地多观察几个视野。阴性反应不出现荧光。30质控芯片PositiveReaktionIgAPositiveReaktionIgGPositiveReaktionIgMPositiveReaktionIgAGM为什么要使用质控芯片?确认使用了正确的二抗。显示样本和结合物温育过程正确。容易找到显微镜对焦屏面。欧蒙梅毒荧光片示例32梅毒IgG阳性梅毒IgM阳性4种方法特异度和敏感度比较，FTA-ABS方法优于其他3种方法。TPPA/TPHA•TPPA致敏明胶颗粒v.sTPHA致敏羊红细胞•TPPA：明胶粒子为洋红色，操作方便，2小时后观察结果•每份标本做4孔，第3孔不出现凝集为有效试验–阳性：第3孔不出现凝集，第4孔出现1+～4+凝集反应。–阴性：第3、4孔均不产生凝集反应。抗原：整菌或其片段颗粒：明胶颗粒34TP-ELISA重组梅毒螺旋体抗原包被的固相板条患者血清单克隆抗体酶标记物酶联检测仪判定阳性反应++结果便于保存、成本低、可应用于自动化检测系统35欧蒙TP-ELISAELISA包被基质:p15,p17,p47和TmpA等特异性重组梅毒抗原可分别检测不同的抗体类型(IgM/IgG)定量检测(IgG)或半定量检测(IgG或IgM)通过全自动酶免分析仪可完全实现自动化操作与TPHA/TPPA实验具有高度相关性36TP-RT•梅毒免疫层析法：测梅毒螺旋体抗体的快速试验之一•操作简单，不需仪器阴性阳性若C带和T带都未出现，则检测无效。阳性37CLIA•化学发光免疫分析法：–放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）与酶联免疫分析（Enzymeimmunoassay，EIA）的结合–采用双抗夹心法的原理，使用化学发光底物取代传统的显色底物，增加了检测的灵敏度。酶催化底物发光38WB•梅毒螺旋体蛋白印迹试验：–又称免疫印迹法（Westernblot,WB）–原理：将梅毒螺旋体Nichols株菌体细胞破碎，使用凝胶电泳将梅毒螺旋体各种抗原成分转印到膜条上作为固相。膜条与待测血清和酶标抗体孵育,底物显色后,当血清中存在梅毒特异性抗体时,则在印迹膜上相应的特异性多肽抗原位置出现显色条带。39梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）2008欧洲公认确认金标准40WesternblotCL1CL3CL2包含三条不同心磷脂抗原浓度的条带p15p17p45p47特异性梅毒抗原:TpN15,TpN17,TpN45和TpN47•梅毒特异性抗体的检测:梅毒感染的确认实验•抗心磷脂抗体的检测:疾病活动性和疗效观察欧蒙WB41检测膜条上抗原的特异性条带抗原特异性47kDa膜蛋白，TpN47特异45kDatmpA特异22kDap22非特异17kDa膜蛋白，TpN17特异15kDa膜蛋白，TpN15特异CL3、2、1心磷脂疾病活动性标记物，特异结果判断结果抗原带着色的特点阴性无特异抗原带显色可疑一条特异抗原带明确显色：p15kDa,p17kDa,p45kDa或p47kDa阳性下列特异抗原带多于一条明确显色：p15kDa,p17kDa,p45kDa或p47kDa心磷脂条带结果判断结果抗原带着色的特点阳性CL1条带明确显色（CL2与CL3条带显色弱表明感染的活动性增强）阴性CL1至CL3无条带显色或CL1条带有较弱着色阳性45免疫印迹法检测为梅毒检测欧洲金标准46全国梅毒考评，免疫印迹法检测作为梅毒确认试剂欧蒙WB•目前已开发出自动化检测仪器及判读软件。梅毒感染血清学检测的临床意义•不同方法的检测对象和原理不同，适用于不同状况和目的下的梅毒检测非特异性抗体检测疗效观察、判愈、判定复发及再感染。可能有生物学假阳性特异性抗体检测敏感性高、特异性强排除假阳性48梅毒血清学试验结果解释（梅毒临床诊断参考依据）试验结果参考结果解释*梅毒螺旋体抗原血清试验非梅毒螺旋体抗原血清试验阳性阳性可能为现症梅毒阴性阳性可能为非梅毒螺旋体血清试验假阳性阳性阴性临床治愈的早期梅毒（既往感染者）或极早期梅毒阴性阴性排除梅毒感染或极