PCR技术的原理及应用

PCR技术的原理及应用PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史•DNA的复制•核酸体外扩增的设想•聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段DNA聚合酶引物引物M13噬菌体Sanger的测序技术引物DNA聚合酶引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段94℃变性50-65℃退火XX℃延伸94℃55℃37℃TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402072℃94℃55℃PCR循环PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（℃）PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第1轮结束95℃第2轮开始PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点72℃第2轮结束PCR的基本原理•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用提纲在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR定义常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析。无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。实时荧光定量PCR原理实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析三个概念：扩增曲线、荧光阈值、Ct值实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR原理--------扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件实时荧光定量PCR原理-------荧光阈值荧光信号阈值（threshold）：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准差的10倍手动设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99真正的信号:荧光信号超过域值实时荧光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。C(t)value实时荧光定量PCR原理-------Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性实时荧光定量PCR原理---------定量原理•理想的PCR反应：•X=X0*2n•非理想的PCR反应：•X=X0(1+Ex)n•n：扩增反应的循环次数•X：第n次循环后的产物量•X0：初始模板量•Ex：扩增效率实时荧光定量PCR原理---------定量原理在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M方程式(1)两边同时取对数得:lgM=lgX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量。实时荧光定量PCR原理---------标准曲线模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。确定未知样品的C(t)值通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理绝对定量25提纲实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的几种方法介绍实时荧光定量PCR实验设计及应用非特异性荧光标记：1、SYBRGreenⅠ特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon4、Amplisensor实时荧光定量PCR原理---DNA产物的荧光标记QQR实时荧光定量PCR方法1－－－SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ法SYBRGreenⅠ能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreenⅠ只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreenⅠ发荧光，在此阶段采集荧光信号（一般设置在复性阶段）。SYBRGreen实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI工作原理5’3’5’3’SGNoEmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析温度荧光强度TmTm值：DNA解链一半时的温度实时荧光定量PCR原理SYBRGreenI熔解曲线分析将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT)-dIdTTmSYBRGreenⅠ法融解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，有杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确非特异性产物CyclenumberFlourescenc104102SampleCyclenumberLgofDNAconcentrationSYBRGreenⅠ法定量原理模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少。Lg浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量。SYBRGreenⅠ法--------PCR反应的建立反应体系的建立及优化:1.SYBRGreenⅠ使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测2.Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准3.MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物4.反应Buffer体系的优化5.反应温度和时间参数:由酶和引物决定6.其他与常规PCR相同SYBRGreenⅠ法应用范围起始模板的测定基因型的分析融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。SYBRGreenⅠ法优缺点对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点本单位目前开展的工作•多种病原体定量和定性•细胞因子检测（人，小鼠，大鼠等）•基因表达水平检测•PCR芯片实时荧光定量PCR方法2-------TaqMan法与目标序列互补TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光（荧光共振能量转移原理，FRET）Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针TaqMan法工作原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光TaqMan法PCR反应的建立1、引物、探针的设计：探针Tm为68-70℃，30bp,5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，引物尽量靠近探针，扩增片段400bp，引物Tm为59-60℃2、反应参数的确定：一般为：94℃，10-20S60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃最高）也可通过温度梯度优化退火温度72℃，45S，3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值引物浓度：50-900nM探针浓度：50-250nM4、其他与常规PCR相同已肝病人血液中HBV的绝对定量目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测设置对照：浓度为106、105、104、103的标准样品各一个，设阴性和空白对照实验步骤：提取HBVDNA设计特异引物设计TaqMan探针并标记探针扩增程序结果：获取血液样品中HBVDN