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色谱分析课程AnalysisDept.分析部提供色谱分析和分离纯化服务•◆色谱分析项目包括以下:•LC-MS•HPLC•GC-MS•ChiralHPLC•◆分离纯化项目包括以下:•PREP-HPLC•ChiralPREP-HPLCLC-MS◆一.送样注意事项•1.均匀取样:将样品混合好再取样。•2.送样量：固体约为1mg、液体约为10ul。•3.要求样品必须澄清透明，以免损坏色谱柱；•若样品混浊,请用滤头过滤后再测样.•4.请使用甲醇、乙腈、水、THF、DMSO、•DMF等极性溶剂溶解样品，尽量避免使用正•己烷等非极性、弱极性溶剂溶样.•5.设样时请自己记住样品报告的Datafile,以便快•速查找报告.•6.正在进样时不能往样品盘放样品.◆二.仪器的配置LC/MS(Agilent1100LC,VLMS;Shimadzu2010A)ESLD(SEDEX75;PL1000)•→ESLD•HPLC→DAD→•→MSD•样品先经过色谱柱的分离后进行DAD测试，再分流两路进入ELSD和MS检测器测试。◆.检测器的说明二极管阵列检测器(Diode-ArrayDetector,DAD)分析整个波长范围(190nm-800nm)有吸收的组分,提供三维信息(T--A),确定最大吸收波长.其中在我们的报告提取波长为214nm的色谱图.蒸发光散射检测器(Evaporationlight-scatterDetector,ELSD)是一种质量型检测器，对所有固体物质均有几乎相等的响应，与待测物的光学性质或电化学性质无关,故对于没有光学吸收特征的物质可获得检测.•液质联用(liquidChromatagraphy-MassSpectrometry)可提供色谱,光谱,质谱等多种信息,•其中在我们的报告中打印有总离子色谱图(Totalioncurrentchromatogram,TIC),提取离子色谱图(extractionchromatogram,EIC),质谱棒状图(Massspectrum)•总离子色谱图TIC---分析时间内所有扫描获得的离子•流强度对时间作图所得的色谱图.•提取离子色谱图EIC—根据监测化合物分子量提取其产生的离子流强度对时间作图所得的色谱图.•质谱棒状图---不同质量的离子质荷比与其相对的离子强度所形成的谱图三.色谱条件:◆酸性条件:0.05%-0.01%TFAinACNandH2O;gradient10%to90%;酸法1-L-P常规酸法正离子1-L-P-S短柱酸法正离子1-L-P-CNCN基柱酸法正离子◆碱性条件:ACN/10mMNH4HCO3inH2O;gradient10%to90%;碱法2-L-P碱法正离子2-L-N碱法负子•4.图谱分析分析报告的格式与解释图1：ADCELSD：蒸发光散射检测器检测的色谱图。图2：DAD214nm紫外波长为214nm的色谱图.对于较纯的样品，色谱峰在1000mAu范围内表明样品浓度较适宜,若色谱峰过高，表明样品浓度较高，所检测出的杂质百分含量校高。图3：MSDTIC总离子色谱图图4：EIC提取离子色谱图;正离子模式（pos,positive+H，+Na）或负离子模式（neg，negative-H）。图5：质谱棒状图。积分结果表：分别表示ELSD、DAD214nm色谱峰的面积百分比,其中MSBase项提供的数据因软件问题有所出入，该项数据不作参考。×××××××××××××三.图谱的特殊说明1.无机盐在ELSD上有信号,而MS,UV无信号.min012345678mAu1000150020002500ADC1B,ELSD(06164268.D)3.1274.075min012345678mAU025050075010001250DAD1B,Sig=214,4Ref=360,80(06164268.D)4.0035.4105.602min012345678050000100000150000200000MSD1TIC,MSFile(06164268.D)API-ES,Pos,Scan,Frag:804.1772.样品的分子量小,易挥发,ELSD出现无信号min02468mAU415420425ADC1A,ADC1CHANNELA(10224206.D)0.362min02468mAU0200400600DAD1B,Sig=214,4Ref=360,80(10224206.D)4.2545.937min024680100000200000300000MSD1TIC,MSFile(10224206.D)API-ES,Pos,Scan,Frag:804.367min024680100000200000MSD1152,EIC=151:153(10224206.D)API-ES,Pos,Scan,Frag:804.3823.不易电离的化合物，MS出现无信号,需外送做EI；极性弱，易挥发样品,需外送做GC-MSmin012345678mAU5001000150020002500300035004000ADC1A,ADC1CHANNELA(08054103.D)5.1925.562min012345678mAU0100200300400500600700DAD1B,Sig=214,4Ref=360,80(08054103.D)5.0585.428min01234567820000400006000080000100000120000140000MSD1TIC,MSFile(08054103.D)API-ES,Neg,Scan,Frag:80NSFNHSO2CH34.溶剂（DMSO、THF、ETAC等）在UV214有信号，而在MS、ELSD上无信号。min0123456mAu400420440460480500ADC1A,ADC1(10194268.D)3.503min0123456mAU0500100015002000DAD1B,Sig=214,4Ref=360,80(10194268.D)DMSO2.6653.3584.077min0123456020000400006000080000100000MSD1TIC,MSFile(10194268.D)API-ES,Pos,Scan,Frag:803.3583.4913.892min0123456mAu50075010001250150017502000ADC1A,ELSD(B0902294.D)4.868min0123456mAU0250500750100012501500DAD1A,Sig=214,4Ref=360,80(B0902294.D)3.9444.7065.359min01234560100000200000300000400000500000MSD1TIC,MSFile(B0902294.D)API-ES,Pos,Scan,Frag:804.796nm220240260280300320340360380mAU020040060080010001200*DAD1,0.896(1418mAU,-)Ref=0.003&5.316ofB0902294.D四.关于分子量的解释和注意事项•在画分子结构的过程中，我们发现含Cl、Br、S等有同位素且丰度较高的化合物使用CHEMDRAW和ISISDRAW计算出的分子量有出入，后者计算出的分子量往往是错误的，所以统一规定大家都用CHEMDRAW计算分子量。•以C6H6NCl为例举例说明几个概念准确分子量（Exactmass)：是用较轻同位素35Cl计算出的分子量平均分子量：是用同位素35Cl和37Cl自然丰度加权平均算出的分子量我们质谱棒状图最前面的线的质荷比就是准确分子量用CHEMDRAW计算分子量如下NClClChemicalFormula:C6H5Cl2NExactMass:160.98MolecularWeight:162.02m/z:160.98(100.0%),162.98(63.9%),164.97(10.2%),161.98(6.9%),163.98(4.2%)ElementalAnalysis:C,44.48;H,3.11;Cl,43.76;N,8.65用ISISDRAW计算分子量如下NClClMolecularWeight=162.02ExactMass=161MolecularFormula=C6H5Cl2NMolecularComposition=C44.48%H3.11%Cl43.76%N8.65%五.Easy-Access使用说明Easy-Access界面一按Submit键提交样品界面三输入样品相关信息后Loadsamples界面四按照提示放好样品按OK确认后回到界面一查看数据编号PREP-HPLC◆一.PREP-HPLC反相体系•通常为水-有机相(甲醇、乙腈);为获得良好的色谱分离效果，有时会加入后处理可除去的酸、碱、盐。◆二.分离纯化体系的选择应与化合物的性质相关。•1.正相分离手段应作为首选纯化的办法•2.在正相系统不能分离及其极性在中等或较大的化合物才适合用反相PREP-HPLC体系.•3.在甲醇、乙腈、DMF、DMSO或THF中有良好的溶解性样品适合用反相PREP-HPLC体系.◆三.送样要求:•1.样品中不应含有强酸及强碱以及其它对色谱柱产生损害的物质•2.样品中不应含有较大量的无机盐，防止堵塞柱子及流路。•3.目标化合物含量应尽可能大于20%，样品颜色深含量低的可先过柱（薄板）后再送制备。•4.送样时请附上制备前的分析图谱，•5.样品溶解性差、稳定性差的要对制备人员说清楚。•ChiralHPLC◆送样要求•送样量：固体约为1mg、液体约为10ul。请注明所用溶剂及样品浓度。•送手性分析的样品，HPLC纯度必须在90%以上。GC-MS◆送样要求•１.GC-MS适合于做挥发性及热稳定的样品，送样时请注意样品的性质（无机盐不能做）。•２．送样人员送样时应附有送样单并在分析人员提供的样品登记单上登记。•３．均匀取样。•４.送样量：固体约为0.1mg、液体约为1ul。若使用特殊溶剂需注明。•５.样品请使用离心管或样品瓶送样。若样品不稳定，请使用棕色送样瓶。•６.请按送样单的要求逐项正确完整填写。正确填写样品编号、分子式、分子量和化学结构；如果知道沸点请注明；若样品不稳定、样品回收需注明。请注意，一定要填写化合物的分子式，知道沸点的请注明沸点。•７所送样品如为液态，请务必注明有无剂，所加溶剂，样品的大致浓度；并且请避免使用与目标化合物沸点接近的溶剂；低于100℃沸点的化合物最好不要加溶剂，请送纯样品。•８．样品中不得含有超过１０％的水，以及大量的无机酸、碱。