抗炎作用实验研究思路与方法

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资源描述

•炎症反应是临床常见病理生理过程,感染、缺血、抗原-抗体反应、化学、热或机械损伤等均可诱发炎症反应。•中药中具有明确抗炎作用的药物类别有:•解表药,清热药,祛风湿药,泻下药,温里药,活血化瘀药,化痰止咳平喘药,开窍药等实验动物的选择•哺乳动物,雄性。•足趾肿胀法用大鼠。•过敏性炎症首选豚鼠。常用抗炎实验方法•根据致炎性质的不同分为两大类:(一)非特异性炎症模型:•致炎因子主要有:异性蛋白(如鸡蛋清)、颗粒性异物(如角叉菜胶*、棉球、酵母)、化学物质(二甲苯、松节油、甲醛)(二)免疫性炎症模型:•细胞介导的超敏反应性炎症,免疫复合物介导的炎症反应模型。(一)非特异性炎症模型•非特异性炎症反应有三期:•早期(急性)炎症时相,以局部血管扩张和毛细血管通透性增加为特征;•中期(亚急性)时相,以血小板粘附、白细胞和吞噬细胞的浸润为特征;•炎症晚期(慢性增殖期)以纤维组织增生、纤维化和肉芽屏障形成为特征。急性和亚急性炎症的实验方法:1、毛细血管通透性测定:•评价药物对炎症物质引起的血管通透性增加的抑制作用。【原理】常用染料渗出法,如伊文思蓝与血浆蛋白稳固结合,当致炎因子(醋酸,组织胺,5-羟色胺,PG等)诱导毛细血管通透性升高时,在一定范围内染料的漏出量可反应渗出毛细血管的血浆蛋白量。【方法一】•取雄性大鼠或小鼠,随机分组,给予受试药物、阳性药物或生理盐水。•30min后,在已剃毛的背部两个部位分别皮内注射组胺和5-羟色胺,立即静脉注射1%伊文思蓝溶液。•15min后,处死动物,剥离背部皮肤,测量注射部位着色面积,或者剪下着色皮肤,切碎,在水-丙酮溶液中浸泡24-48h,过滤,分光光度计比色。[评价]本法操作简单,但操作时应注意:伊文斯兰注入量一定要准确,滴二甲苯浸润皮肤要仔细。皮肤毛细血管通透性增高是抗炎作用研究的最常用的模型之一。操作简单,重现性较好。实验结果直观。【方法二】•取小鼠随机分组,给药1-2小时后,各鼠静脉注射0.5%伊文斯兰生理盐水溶液0.1ml/10g,随即腹腔注射0.6%HAC0.2ml/只,20min后处死动物,打开腹腔,用生理盐水分次冲洗腹腔,合并洗涤液离心,取上清液590nm处比色测定,计算腹腔染料量,评价毛细血管通透性。、炎性肿胀的测定(1)小鼠耳廓肿胀法:耳廓涂抹致炎剂•致炎剂:二甲苯,巴豆油合剂。(2)大鼠足趾肿胀法:足趾皮下注射致炎剂•致炎剂:鸡蛋清,角叉菜胶,酵母,甲醛,右旋糖酐,酵母液,组胺,5-羟色胺,制霉菌素•检测指标•大鼠足趾肿胀法,测定大鼠足趾或关节的周长、厚度或整个足趾、踝关节的容积。•小鼠耳廓肿胀法,测定小鼠耳廓重量或者厚度。【评价】脚肿胀模型是最常用的抗炎实验模型,多种化学、物理以及免疫学刺激均可导致大鼠脚爪水肿,因水肿发展和消退的快慢及持续时间不同,可将其分为急性、亚急性和慢性脚肿胀,急性脚肿胀一般于给与致炎剂数十分钟或1-3小时炎症迅速发展至高峰,数小时内会消退。慢性脚肿胀于数至十日以上发展逐渐达高峰,亚急性介于中间。•化学物质刺激所致急性脚肿胀最常用,如组织胺、5-羟色胺、缓激肽、PGs、角叉菜胶、右旋糖酐、新鲜鸡蛋清、甲醛、酵母、琼脂等。•芥子末、制霉菌素可以制备亚急性肿胀。炎症慢性增殖期模型•肉芽肿模型:•应用巴豆油、脱脂棉、海绵、玻璃棒、塑料环、纸片等埋入动物局部皮下,可引起与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生,然后观察药物对肉芽重量的影响。常用方法:塑料环法;大鼠巴豆油气囊法;棉球植入法;琼脂皮下注射法等。(二)免疫性炎症模型•细胞免疫、免疫复合物所介导的炎症反应在各种风湿性疾病,尤其是类风湿性关节炎病理过程中起着主导作用,因此这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗风湿药物有重要价值。细胞介导的超敏反应性炎症系由抗原进入机体使T细胞致敏,当再次接触抗原,致敏T细胞分化增殖,释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞,引起单核细胞浸润为主的局部炎症反应。免疫复合物所介导的炎症反应,系由抗原抗体形成复合物,激活补体,导致白细胞趋化激活,释放一系列致炎因子产生局部和全身炎症反应。、大鼠佐剂性关节炎•常作为类风湿性关节炎的一种实验模型。•将弗氏完全佐剂皮内注入大鼠足趾部或尾根部致炎。•原发病变类似于一般炎性水肿,在致炎部位12h后出现肿胀。继发病变由迟发性超敏反应引起,在致炎10d左右后出现对侧、前肢足爪肿胀,耳、尾、出现炎症结节和红斑等。【评价】•本方法特异性高,假阳性率低,结果可靠。属于免疫性关节炎模型。该模型比其他模型更接近于临床类风湿性关节炎(RA)。•弗氏完全佐剂的制备是模型成败的关键。(液体石蜡:羊毛脂(2:1)共热至70℃,混匀,加入灭菌的卡介苗按照每毫升中加2-10mg制备。•动物选择大鼠,雄性,150-200g之间,过小或老均不敏感。、胶原诱导的关节炎•II型胶原是软骨主要成分,具有抗原性,诱发针对关节滑膜的自身免疫反应。•将II型胶原加入弗氏佐剂中,皮内注射如大鼠足趾或尾根部致炎。这两种炎症模型均发生急性局部炎症期(1-4天)、急性炎症缓解期(7-12天)、多发性关节炎为特征的慢性周身炎症期(10-28天)以及永久性关节畸形(第35天以后)【评价】该模型比佐剂性关节炎模型更进一步,更贴近于人的RA,有体液免疫和细胞免疫协同作用,其病理表现为进行性滑膜炎及滑膜增生,炎性细胞浸润,软骨破坏,最终导致关节损伤和僵硬。在临床、组织学和免疫学改变上均与人的RA相似。、对炎症细胞功能的影响(1)多形核白细胞趋化性测定【原理】白细胞聚集是机体防御机制的一个重要方面。趋化因子能吸收白细胞致感染或炎症部位。测定白细胞趋化性的方法有琼脂糖法。(2)巨噬细胞吞噬功能测定【机理】吞噬作用是吞噬细胞接触-胞饮-降解异物的过程。微生物、免疫复合物或其他异物必须先与吞噬细胞结合,才能启动这一作用。、抗炎与垂体-肾上腺皮质系统的关系(1)切除双侧肾上腺大鼠或小鼠的抗炎实验【原理】摘除两侧肾上腺即除去了内分泌系统(下丘脑-垂体-肾上腺轴)的影响,再进行抗炎实验,以观察药物抗炎作用是否与垂体-肾上腺系统有关。(2)血浆皮质醇含量的测定作为一个指标,结合抗炎实验进行。、花生四烯酸代谢测定【原理】花生四烯酸的不同代谢产物涉及炎症过程。、白细胞细胞因子释放实验【原理】细胞因子如白细胞介素IL-1,IL-6,IL-8,肿瘤坏死因子在炎症的发生过程中发挥重要作用。检测药物对白细胞释放上述细胞因子的影响可反映药物的抗炎活性。

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