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1酶免测试的工作原理吸光度测试的准确性对于酶免测试结果的重要性酶标仪的组成部分和工作原理第一节比色分析的基本理论许多化学物质具有颜色，有些无色的化合物也可以和显色剂作用而生成有色物质。事实证明，当有色溶液的浓度改变时，颜色的深浅也随着改变。浓度越大，颜色越深；浓度越小，颜色越浅。因此，可以通过比较溶液颜色深浅的方法来确定有色溶液的浓度，对溶液中所含的物质进行定量分析。如纳氏管比色法，它是按浓度由高到低，配好一系列标准浓度管，然后拿待测样品和标准管逐个比较，看和哪一个标准管的颜色最相近，便读取该标准管的浓度值为待测样品的浓度值，这就是（目视）比色法。这种方法虽然比较简便，但是系列标准管不易保存，误差较大。后来改用光电检测元件代替目视来测量被测溶液中物质的含量，这种方法叫光电比色法。利用这种方法制成的仪器叫光电比色计。光电比色计属于吸收光谱仪器范围。一、光的性质从物理学中我们知道，光具有波动和微粒两种性质，通称光的波粒两象性。在一些场合，光的波动性比较明显；在另一些场合，光则主要表现为微粒性。首先，光是一种电磁波。可以用描述电磁波的术语，如振动频率（υ）、波长（λ）、速度（c）、周期（T）来描述它。我们日常所见到的白光，便是波长在400～760nm之间的电磁波，它是由红橙黄绿青蓝紫等色，按照一定比例混合而成的复合光。不同波长的光被人眼所感受到的颜色是不同的。在可见光之外是红外线和紫外线。各种色光及红外线、紫外线的近似波长范围如表1所示。表1各种色光及红外线、紫外线的近似近波范围单位：nm颜色波长范围颜色波长范围远红外线10001～1000000绿501～560中红外线2501～10001青481～500近红外线761～2500蓝431～480红621～760紫401～430橙591～620普通紫外线191～400黄561～590真空紫外线1-190除了波动性外，光还具有微粒性。在辐射能量时，光是以单个的、一份一份的能量（E＝hυ）的形式辐射的。式中υ是光的频率，h为普朗克常量。同样，光被吸收时，其能量一份一份地被吸收的。因此，我们可以说，光是由具有能量（hυ）的微粒所组成的，这种微粒被称为光子。由式中可知，不同波长的光子具有不同的能量。波长越短，即频率越高，能量越大。反之亦然。光子的存在可以从光电效应中得到充分的证明。二、光的互补及有色物质的显色原理若把某两种颜色的光按照一定的比例混合，能够得到白色光的话，则这两种颜色的光就叫做互补色。图1中处于直线关系的两种光为互补色。如绿光和紫光为互补色，黄光和蓝光2为互补色等等。图1互补色光示意图图2高锰酸钾溶液的光吸收曲线物质的颜色与光的吸收、透过、反射有关。由于物质的性质和形态不同，所以呈现出不同的颜色。透明物质的颜色就是它透过光波的颜色。不透明物质的颜色是其反射光波的颜色。有色溶液对光的吸收是有选择性的。各种溶液之所以会呈现不同的颜色，其原因是因为溶液中的有色质点（分子或离子）选择性地吸收某种颜色的光所致。实践证明，溶液所呈现的颜色是它的主要吸收光的互补色。如一束白光通过高锰酸钾溶液时，绿光大部分被选择吸收，其他的光透过溶液。从互补色示意图可以看出，透过光中除紫色外，其他颜色的光两两互补。透过光中只剩下紫色光，所以高锰酸钾呈紫色。通常用吸收曲线来描述溶液对各种波长的光的吸收情况。让不同波长的光通过一定浓度的有色溶液，分别测出它对各种波长的光的吸收程度（用吸光度A来表示），以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，所得到的曲线称为溶液的吸收曲线或吸收光谱图。例如，高锰酸钾吸收曲线如图所示。图2中C1、C2、C3分别代表不同的浓度，C1C2C3。从图2中可以看出，在可见光范围内，高锰酸钾溶液对波长为525nm左右的绿色光吸收程度最大，而对紫色和红色光很少吸收。对于任何一种有色溶液，都可以测绘出它的吸收曲线。光吸收最大处所对应的波长叫最大吸收波长。浓度不同的同一种溶液，其吸收光谱的形状和最大吸收波长是一样的，也就是说，不同的物质都具有其特定的吸收光谱。如同根据指纹可以辨认众人一样，在光谱分析中，可以根据吸收光谱的不同来鉴别物质。从图2中还可以看出，溶液的浓度越大，对（绿）光的吸收程度越大。因此，可以利用这部分光线通过溶液后被吸收的程度来确定溶液的浓度。如可用绿色光来对高锰酸钾溶液进行比色测定。由于有色物质对光的吸收具有选择性，因此，在进行比色测定时，只能用光波中能被有色溶液吸收的那部分光线，即应该有单色光进行比色测定。至于不被有色溶液吸收的光线，则应设定在未透过有色溶液之前或之后将其消除掉。滤光片就起这个作用。根据前面所叙述的理由可知，选择滤光片的原则应是：滤光片的颜色应与待测溶液的颜色为互补色。三、朗伯-比尔（Lamber-Beer）定律溶液颜色的深浅与浓度之间的数量关系可以用吸收定律来描述。它是由朗伯定律和比尔定律相结合而成的，所以又称朗伯-比尔定律。当一束平行单色光照射到均匀、非散射的溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被比色皿的表面所反射。设入射光的强度为IO，吸光度的强度为Ia，反射光的强度为Ir，透过光的强度为It。则它们之间有如下关系：3Io＝Ia+Ir+It在实际比色分析时，所用的比色皿都是同质料、同规格的，因此反射光的强度为一定值，不会引起误差，即反射光的影响可以不考虑。这样，上式可简化为：Io＝Ia+It当入射光的强度一定时，被吸收的光的强度越大，透过光的强度就越小。这就是说，光强的减弱仅仅与有色溶液对光的吸收有关。在比色分析中，常把透过光的强度占入射光的强度的百分比[(It/Io)％]称为透过率或透射比，用T表示，即T＝（It/Io）％。T越大，表明有色溶液的透光程度越大。当一束平行单色光通过有色溶液时，由于溶液吸收了一部分光线，光线的强度就要减弱。溶液的浓度越大、透过的液层越厚、入射的光线越强，则对光线的吸收就越多。如果入射光的强度不同，则光的吸收只与液层厚度及溶液的浓度有关。它们之间的关系可以用下式表示：A＝K·C·L式中，A为吸光度；K为吸（消）光系数；C为溶液的浓度；L为液层厚度。此公式说明：在入射光一定时，溶液的吸光度与溶液的浓度及液层厚度成正比。此式就是光的吸收定律的数学表达式，又叫朗伯-比尔定律。这一定律是比色分析和其他吸收光谱分析的理论基础。吸光系数K＝A/（C·L），它表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。在入射光的波长、溶液的种类和温度一定的条件下，K为定值。K值越大，说明比色分析时的灵敏度越高。吸光度A与透射比T的关系如下：A＝－lgT即吸光度A与透射比T的负对数成正比。四、定量方法用光电比色计和分光光度计测定有色溶液的浓度有计算法和标准曲线法两种。计算法必须严格遵守朗伯-比尔定律的应用条件，方能得到准确的结果。（一）计算法根据被测溶液浓度的大致范围，先配制一已知浓度的标准溶液。用同样的方法处理标准与被测溶液，使其成色后，在同样的实验条件下，用同一台仪器分别测出它们的吸光度。在标准溶液中：AS＝KS·CS·LS在待测溶液中：Ax＝Kx·Cx·Lx将两式相除可得：AS/Ax＝KS·CS·LS/（Kx·Cx·Lx）如果测定时选用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波长的单色光，再保持温度相同，则K也相等。这样上式可简化为：AS/Ax＝CS/Cx由此可见，在满足上述条件下，溶液的吸光度与其浓度成正比。这一关系式是设计光电比色计和分光光度计的基础，也是比色分析的基本计算公式之一。式中标准溶液的浓度已知，AS和Ax可以用光电比色计测量出来，这样，待测溶液的浓度便可以由下式求出：Cx＝CS·Ax/AS由于仪器的性能和工作环境都是在不断变化的，因此，在采用计算机时，必须每次都要对标准液和被测液进行测量，然后利用上式进行计算，否则，会带来较大的测量误差。再者，光电比色计在使用时，一般都或多或少会偏离朗伯-比尔定律，故欲得到准确的测量结果，4常采用标准曲线法。（二）标准曲线法这种方法分以下几步进行：(1)先配制5种以上标准浓度的溶液；(2)测出每种溶液的吸光度A；(3)做A、C标准曲线图，如图3所示。图3标准曲线有了标准曲线图，便可以对溶液进行测量。在同样工作条件下，用仪器测出Ax后，查标准曲线，即可求得被测溶液的浓度值Cx。为了方便工作，现代光电比色计大都加有对数运算放大器，使用时只要选用一种合适的标准溶液进行定标，然后便可以直接读取溶液的浓度值，使工作效率大大提高。第二节光电比色计的基本结构利用光电池或光电管等光电元件作检测器，来测量通过有色溶液的透射比或吸光度，进而求出物质含量的方法叫光电比色法。基于这种方法而设计成的仪器叫光电比色计。一般的光电比色计由光源、滤光片、比色皿、光电检测器、放大和显示等6部分组成。光电比色计的方框图如图4所示。图4光电比色计方框图光源发出的复合光经滤光片滤除后，变为近似的单色光。此单色光通过比色皿时，被比色皿中盛放的样品液吸收掉一部分，然后照在光电检测器上。光电检测器将照在它上面的光信号的强弱转变为电信号的大小，最后由显示部分将测量结果显示出来。一、光源理想的光源应在整个所需要的波长范围内具有均匀的发光强度，也就是说，它的光谱5应该包括所用的波长范围内有波长的光，光的强度应该足够大，并且在整个光谱区中，其强度不应随波长有显示的变化。实际上，这种理想的光源并不存在，所有光源的光强都随波长而变。在可见光范围内常用的光源有钨丝灯和卤钨灯。（一）钨丝灯钨丝灯是可见光区和近红外区最常用的光源，它适应的波长范围在320～2500nm之间，如图5所示。钨丝灯靠电能将钨丝加热至白炽而发光，它的光谱分布与灯丝的工作温度有关。钨丝灯的特点是结构简单、价格便宜、寿命较长，通常可以工作1000h以上。图5钨丝灯的能量曲线其不足之处是，在点燃时钨丝会不断向外蒸发出钨分子。灯丝的温度越高，蒸发速度越快。钨丝的蒸发会使灯丝变细，缩短寿命，更重要的影响是蒸发出的钨分子到达灯泡的内壁时，会沉积在内壁上，随着工作时间的延长，内壁沉积的钨会越来越厚，使灯泡透出来的光越来越弱。严重的会使灯壁发黑，无法使用。使用卤钨灯可以解决这一问题。（二）卤钨灯卤钨灯是在钨灯中加入适量的卤素或卤化物（如碘钨灯内加入纯碘，溴钨灯中加入溴化氢）而制成的，有时也称作钨卤素灯和卤素灯。其灯壁多采用石英或高硅氧玻璃。卤钨灯有比普通钨灯高得多的发光效率和长得多的寿命，这主要是因为在卤钨灯中，钨蒸气在靠近灯壁的低温区与卤素相结合，生成了挥发性的卤化钨气体。由于灯泡内的热对流，使卤化钨气体产生流动。当卤化钨碰上高温灯丝时，又分解成卤素和钨。钨沉积在灯丝上，而卤素再继续扩散到温度较低的灯壁区与钨化合。这一过程一般称为卤钨循环或钨的再生循环。这一循环大大减少了钨在灯泡内壁的沉积，它不但延长了灯泡的寿命，还提高了灯泡的性能。卤钨灯的寿命通常可达2000h以上，它的另一优点是体积比同功率的钨丝灯要小得多。钨灯（包括卤钨灯）的发光稳定度与所加的电压有密切的关系。已知在可见光区，其能量输出的波动约为所加电压波动的4次方倍。为了获得稳定的测量结果，保持光源灯发光的稳定性是非常重要的，这就要求给光源灯提供稳定的供电电压。这两种钨灯既可以用交流供电，也可以用直流供电。在交流供电时，通常采用磁饱和稳压器供电。在直流供电时，通常采用电子稳压电路供电。目前，绝大部分采用直流供电。二、滤光片滤光片又叫滤色片，其作用是控制波长或能量的分布，即它只让一定波长范围内的光通过，而将其余不需要的波长的光滤去，相当于电路中的带通滤波器。滤光片通过的波长范围越窄、透射比越大，说明其质量越好。滤光片通过单色光的纯度，通常用其光谱特性曲线的半宽度表示。图6是一块蓝色滤6光片的透射比曲线。曲线上与最大透射比TM对应的波长（480nm），叫峰值波长。与最大透射比的一半（TM/2）相对应的A、B两点之间的波长差，叫半宽度。即：半宽度＝λ2-λ1。图6中的半宽度＝530-430＝100nm。半宽度越小，表示透过的单色光越纯。常用的波光片有吸收滤光片、干涉滤光片、复合滤光片等。图6吸收滤光片的透光曲线（一）吸收滤光片吸收