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1钼矿周围土壤中微生物的分离与鉴定步骤一钼矿周围土壤的采集与处理一、采集地点：河南省、洛阳市、栾川县钼矿区土壤。二、实验器材：无菌牛皮纸袋，无菌铲，长线，标杆，标签，尺子，冰箱。三、样本采集及处理方法:1.取样：2012年3月于洛阳市栾川县钼矿区土地选择2个不同的地点进行采样，分别在4个方向选取3点，每个地点在不同位置各取3个样，直取5~20cm深度的土壤，每点按1m×1m取样，每点取样量一致，将样点土壤混均后取200g装入无菌牛皮纸袋中封好，带回实验室放入灭菌的袋中或放在4℃冰箱中暂存备用。采样注意事项：(1)样品标记：采集的样品放入统一的灭过菌的牛皮纸袋样中，用铅笔填写好标签，袋内外各具一张。(2)一个混合土样以取土1公斤左右为宜，如果样品数量太多，可用四分法将多余的土壤弃去（方法是将采集的土壤样品放在洁净的塑料布上，弄碎、混匀，铺成四方形，划对角线将土样分成四份，把对角的两份分别合并成一份，保留一份，弃去一份，果所的样品依然很多，可用四分法处理，直至所需数量为止）。(3)采样深度，对一般土地采样深度5—30cm即可，采样时深度要垂直，上下取土量要一致，每个采样点的取土深度及采样量应均匀一致，土壤上层与下层的比例要相同，取样器应垂直于地面入土，深度相同，用铁锨取样应先铲出一个耕层断面，再平行于断面下铲取土。(4)采样量，1—2kg土量。(5)预处理及保存：将采集的样品平摊在聚乙烯塑料布上，在室温下阴干，土块捏碎，并拣除植物根、茎、叶及石块杂物，经20号筛筛分。(6)采用梅花形采样法，对于面积不大，地势平坦，土壤较均匀的田块，适合用这种方法，花形采样的布点以5—10个为宜。2.样品处理：将土样带回实验室进行处理，即将同一地点的3个土样各称取10g后混合均匀，称取混匀后的土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合将微生物分散，此为10-1稀释；再用1mL无菌吸管吸取1mL稀释后的土壤溶液注入盛有9mL无菌水的试管中，将吸管吹洗3次充分混匀，即成10-2土壤稀释液；依次类推将土样依次稀释为10-3，10-4，10-5，10-6的土样稀释梯度[1-2]。步骤二培养基的制备一．实验用品小铝锅,天平,牛角匙,1000mL刻度搪瓷杯,玻棒,pH试纸,分装漏斗,石棉网,橡2皮圈,100mL和2000mL烧杯,标签纸,记号笔，可控温电炉,小刀,纱布,报纸，高压灭菌锅，电子分析天平。二,培养基的制备：根据不同微生物适宜生存条件的不同，分别选取适合不同菌种生长的培养基（见表1）。表1培养基种类及适用菌种培养基适合菌种牛肉膏蛋白胨培养基细菌改良高氏一号培养基放线菌马铃薯培养基（PDA）或马丁氏培养基真菌（除霉菌外）察氏培养基霉菌1.牛肉膏蛋白胨培养基的制备（培养细菌）：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂15~20g蒸馏水1000mLpH值7.0～7.2灭菌1.05kg/cm2，121.3℃灭菌22min按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中用玻棒搅匀，在石棉网上加热使其溶解，待药品完全溶解后，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂，后补足所失的水分，用精密pH试纸测原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节，注意pH值不要调过头，以避免回调。2.改良高氏一号合成培养基的制备（培养放线菌）：改良高氏一号合成培养基配制：可溶性淀粉20gKNO31gK2HPO40.5gMgSO4·7H2O0.5gNaCl0.5gFeSO4·7H2O0.01g（母液）琼脂20g水1000mLpH7.2～7.43灭菌1.05kg/cm2，121.3℃，20min配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，倒入少于所需水量的沸水中，在火上加热，边搅拌边依次逐一溶化其他成分，溶化后，补足水分到1000ml，调pH，1.05㎏/㎝2,121.3℃，灭菌20min。高温灭菌后，倒平皿前加入10%酚2滴至100ml培养基中混匀，将培养基倒入平皿内约15ml/皿。3.马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备（PDA培养基）或马丁氏培养基（培养真菌）：马铃薯培养基配制：马铃薯200g蔗糖（或葡萄糖）20g琼脂15~20g水1000mLpH自然（约6.0）马铃薯去皮，切成块加水，煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布（四层）过滤，滤液再加糖及琼脂,，补足水至1000ml，灭菌1.05kg/cm2，121.3℃，20min。马丁氏培养基配制KH2PO41gMgSO4·7H2O0．5g蛋白胨5g葡萄糖10g琼脂15—20g水1000mlpH自然此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml，临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml。4.察氏培养基的制备（培养霉菌）：察氏培养基的制备：硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL制法加热溶解，分装后121℃灭菌20min。三．倒平板4将牛肉膏蛋白炼培养基,改良高氏一号培养基，马铃薯培养基（PDA培养基）或马丁氏培养基培养基和察氏培养基溶化，待冷至55~60℃时，向高氏一号培养基中加入10%酚数滴,然后分别依次倒入事编好号的无菌平皿中，标明培养基类型,每种培养基倒三皿，凝固后37℃恒温箱放置24h，确认无菌后备用。装试管：趁热用分装漏斗分装于18mm×180mm试管,斜面以8mL为宜,柱状15mL为宜，分装完毕后做好棉塞，装入小试管筐并捆好,写好标签，高压蒸汽灭菌,121℃灭菌30min.若需摆斜面，灭菌后趁热摆成斜面。步骤三接种和培养一、实验仪器：接种环，接种针，接种铲，无菌玻璃涂棒,无菌移液管或移液枪，无菌滴管等二、接种方法：1.涂布用无菌移液管将10-1（原液），10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的土样稀释液0.1或0.2或0.5mL倾入皿中（无菌操作），用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，每一梯度涂布3个平行样。三、培养牛肉膏蛋白胨培养基平板倒置培养于,30~37℃培养箱中1~2天,将高氏一号培养基平板倒置培养于,28℃培养箱中5~7天，将马铃薯蔗糖琼脂培养基的制备（PDA培养基）或马丁氏培养基培养基倒置培养于28~30℃培养箱中3~5天，将察氏培养基在28～30℃条件下倒置培养2~3天，观察并记录。（分别在无菌条件下涂布于牛肉膏蛋白胨、高氏1号和马丁培养基制成的平板上，然后置于适宜温度下培养，在30—37℃条件下培养1～2d后对细菌菌落进行计数；在28℃条件下培养5～7d后对放线菌菌落计数；在28～30℃条件下培养3~5d后对霉菌菌落计数，每项试验重复3次。）四、记数：涂抹平板计数法注：涂抹平板计数法：稀释平板测数法采用10-2,10-3,10-4稀释度，先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中,待凝固后编号,然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上,每个编号设三个重复，再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲,更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌.在由低浓度向高浓度涂抹时,也可以不更换刮铲.将涂抹好的平板平放于桌上20～30min,使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转,保温培养，至菌落长出后即可计数。计算结果时,常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度,求出每克菌剂中的含菌数.5(1)同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊.(2)细菌、放线菌、酵母菌以每皿30～300个菌落为宜，霉菌以每皿10～100个菌落为宜，选择好计数的稀释度后,即可统计在平板上长出的菌落数。统计结果按下式计算：涂抹平板计数法:每g样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍。步骤四微生物的分离纯化一、实验材料牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，改良一号琼脂培养基，马丁氏培养基，察氏培养基。钼矿周围土壤分离的微生物，接种环，超净工作台，恒温培养箱。二、实验方法采用划线法分离细菌。采用含与土壤相同钼含量的个微生物对应的培养基进行纯化培养。1.分离挑出的单菌落，用接种环以无菌操作法分别从平板培养基上不同形态菌落中挑取一环菌种，在新培养基中进行划线分离，并标记优势菌种，放入恒温培养箱中培养24h后观察，重复以上操作至培养基上出现单一菌种，分别适温培养，进行分离、纯化，反复三次，将纯化后的菌种编号并接种在相应培养基中，培养48h后4℃下保存备用2.检查：在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。3.纯化：用与土壤钼含量相同的培养基进一步分离纯化分离的菌株并镜检。步骤五菌株的生理生化实验和鉴定一、菌种的分类鉴定主要依据微生物的形态学、生理学和生态学特征对微生物进行初步分类，并对微生物的形态学特征（群体特征、个体特征）、生理生化特征进行鉴定：1.菌落的形态特征主要观察菌落的形状、大小、颜色、粘稠度、透明度、边缘情况及隆起情况、光泽、质地等。2.菌种个体形态特征鉴定主要通过在高倍镜及油镜下观察单一菌株的个体形态、大小及排列情况，有无运动、鞭毛着生位置和数目，芽孢、荚膜的有无来判断。63.生理生化特征实验：对纯化的菌种进行革兰氏染色、糖发酵实验、淀粉水解实验、甲基红实验（M.R.）、伏普实验（V.P.）、柠檬酸盐利用实验、吲哚实验、硫化氢实验、氧化酶实验等并记录结果．4.16s-rDNA的鉴定细菌种属：二，实验方法：1.菌落的观察：用放大镜直接观察菌落特征并记录，并用照相机拍摄菌落照片。2.菌体的观察：先革兰氏染色再在高倍镜及油镜下观察单一菌株的个体形态。3.生理生化特征实验（参照微生物课本）：(1)糖类发酵(分解)试验器具或材料:试管、接种针、恒温箱等,糖类发酵与氧化实验培养基（半固体）操作步骤①接种：以移接18—24小时待鉴定的菌用接种针穿刺接种。接4支，其中2支用灭菌的凡士林或石蜡洋菜上封盖，以隔绝空气为闭管，另2支不封为开管，同时要有不接种的闭管作对照。②培养：置于37度恒温箱中，培养8—16个小时，1天、3天和7天③观察：在上述培养时间内观察试管中指示剂的变化情况结果:在8小时、16小时检查，若培养基柱上部变黄，下部仍为绿色，则证明为氧化型，全部变黄或下部变黄上部为绿，则为发酵型。(2).V-P试验（二乙酰试验）(3).甲基红实验（M.R.）(4).淀粉水解试验(5).吲哚试验(6).过氧化酶测定(7).柠檬酸盐利用试验4.16s-rDNA的鉴定细菌种属注：查伯杰氏手册主要参考《伯杰细菌鉴手册》,《真菌的形态和分类》根据菌落形态、染色性质及生理生化性质查分离出的菌为哪几种菌。参考文献：[1]卞立红,高凤清,汪洋等.大庆盐碱土壤中微生物的分离纯化[J],高师理科学刊，2010,3(30):74-78[2]孙建,富集金属锂微生物菌株的筛选及其富集特性的研究[D].天津大学硕士学位论文2009,04.[3]李诱,邵玉涛,张仲平.白云鄂博矿区若干微生物的分离和培养[J].阴山学刊,2004,18(1)11-14.[4]张飞鹏，林志伟，张振南等.大庆盐碱土中微生物的分离及芽孢杆菌的鉴定[N].黑龙江八一农垦大学学报,2011,10,23(5).7[5]王立群,张晓东,吴邵萍等.禽粪好氧堆肥发酵高温阶段微生物的分离及其作用[N].东北农业大学学报,2008,2,39(2).[6]江澜,王敏斌，蔡强.抗Cr(VI)微生物的分离筛选术[N].重庆工商大学学报(自然科学版),2008,10,25(5):479-583.