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实验一、质粒DNA的提取和纯化一、实验目的：1、学习并掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的方法。2、初步了解DNA纯化的原理。二、实验原理1、细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。2、质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。3、碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。4、纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。三、实验步骤1、挑取单菌落接种到含Amp的LB液体培养基试管内（3.5ml/管）2、将试管放入恒温震荡培养箱中，37℃，200r/min培养12-16h。3、将菌落转入1.5ml离心管中（尽量倒满）1200r/min，离心30s（沉淀菌体）4、重复一次第三步的过程5、弃掉上清液并扣干，加入预冷的Solution1100微升，剧烈震荡打散菌体6、加入新配置的Solution2200微升，温和颠倒试管6-7次混匀，室温放置5min，使液体由浑浊变为透明粘稠7、加入预冷的Solution3150微升，温和颠倒离心管2-3次，震荡7-8次，之后在1200r/min离心7min8、小心将含有质粒DNA的上清液转移到另一离心管中（400-500微升）9、加等体积的氯仿，轻微震荡，1200r/min，离心2min,之后将上清液转移至另一离心管10、加入2倍体积冰冷无水乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，室温放置2min，1200r/min下离心10min11、弃上清，加入70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心2min，弃上清12、弃上清，液体尽量倒净，并在吸水纸上扣干，室温静置15min干燥13、加入1*TE40微升溶解质粒，用于定量分析、电泳检测等实验二、DNA琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术2、掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。二、实验原理1、关于电泳技术：电泳常用于分离和纯化那些分子大小、电荷性状或分个构象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白质和核酸。正因为如此，电泳已成为生物化学和分子生物学中应用最为广泛的技术之一，其中在分子生物学实验中最为常用的是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖是一种海藻多糖，琼脂糖胶分离范围很大，但其分辨率却相对较低。通过改变琼脂糖凝胶的浓度，应用标准的电泳技术可以分离200到50,000bp大小的DNA片断。一般琼脂糖胶浓度在0.5％到4％之间，且琼脂糖凝胶浓度越大，凝胶就越硬。较高浓度的琼脂糖胶有利于较小的DNA片断分离，而较低浓度的琼脂糖胶则可以分离较大的DNA片断。2、琼脂糖凝胶电泳条带的观察：通过观察示踪染料的迁移距离可以判断DNA的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与300和4000bp大小的双链DNA片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview染色来观察DNA片断。Gelview是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的Gelview溶液中进行染色。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的DNA或RNA进行观察。3、DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的DNA分子泳动速率不一样，可以进行分离。未切割的质粒DNA在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒DNA在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。4、质粒DNA以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：①超螺旋DNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。②线性DNA：当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间。③开环DNA：在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。三、实验步骤1、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。2、水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。3、.待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。4、在槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面5、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。6、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。7、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。8、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，放进EB溶液中进行染色，完全浸泡约30min。9、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm或254nm），通过观察孔进行观察。实验结果分析一、质粒电泳结果质粒DNA在含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳中被染成橘黄色。如图所示，质粒DNA可以观察到3DNA有3种构型即共价闭合环状质粒(cccDNA)、开环质粒(OCDNA)和线状质粒DNA(LDNA)。在凝胶电泳中的迁移速度不同。因此电泳后呈3DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。本次实验的结果中的三条带，也可推测为超螺旋质粒DNA、线状DNA和开环质粒DNA。只是由于操作原因，线性DNA比较多。二、实验结果讨论分析1、为获得高纯度的质粒DNA，必须彻底去除杂蛋白、染色体DNA和RNA。在整个质粒提取过程中出去染色体DNA的关键步骤是加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的变性和复性环节，应控制好变性和复性的时机。加入溶液Ⅰ时，可剧烈震荡，使菌体沉淀转变成均匀的菌悬液，此时细胞尚未破裂，染色体不会断裂；加入溶液Ⅱ时，菌液变粘稠、透明，无菌块残留；加入溶液Ⅲ时，会立即出现白色沉淀。加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后，应缓慢上下颠倒离心管数次，切忌在旋涡振荡器上剧烈振荡，否则染色体DNA会断裂成小片段，不形成沉淀，而溶解在溶液中，与质粒DNA混合在一起，不利于质粒DNA提纯。因此，操作时一定要缓慢柔和，采用上下颠倒的方法，既要使试剂与染色体DNA充分作用，又不破坏染色体的结构。2.、酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。3、为最大限度去除上清，可在倒掉部分上清后，再将离心管放入离心机稍作离心，使残留在管壁的液体集中到离心管底部，再用移液器移除液体。4.、注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速按出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。5、本次实验中，原应灭菌之前加入培养基内的葡萄糖由于操作疏忽而忘记加入，随后按照老师指示配制100mL10%的葡萄糖溶液一起灭菌，待灭菌后再将葡萄糖溶液加入培养基中。6、培养菌体所用的14个锥形瓶有2个锥形瓶中没有菌体生长迹象，另外有2个锥形瓶内菌体生长较少。原因可能是接种时操作失误，例如可能是接种环挑取菌种后离酒精灯火焰太近或者挑取菌种前没有充分冷却，也有可能是接种时接入的菌量过少等。7、在纯化DNA加入冰乙醇的步骤中，2只离心管在加入的DNA样品量相同的情况下，出现了从-20℃环境下取出后2只离心管内液体体积相差较多的情况，分析后发现量较少的1只离心管内加入的各种试剂的量是合适的。可能的原因：①在用移液器移取冰乙醇时下按力度太大，吸入过多液体；②2只离心管分别由2名组员加液，操作上可能出现个人之间的误差。8、本次实验得到的质粒DNA较少，最主要原因是选择了菌体生长较少的培养基，仅得到较少的粗提物，导致最终纯化得到的质粒DNA也较少。