细菌内毒素检查法

细菌内毒素检查法必备的实验材料鲎试剂、细菌内毒素检查用水、细菌内毒素标准、玻璃移液管（或吸嘴）和玻璃试管、恒温箱、旋涡振荡器、消毒棉球，剪刀和封口膜等实验室要求洁净，无尘埃流通，室内温度要求20—25℃为宜。必要时应在超净工作台操作。方法：凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验在使用一批新的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟。取分装有0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值(λc).λc=anti1g(∑X/4)内毒素EU/ml0.50.250.1250.0625阴性反应终点平1行2管3数4//式中X为反应终点浓度的对数值（1g）。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当λc在0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。鲎试剂灵敏度复核试验报告NO:试剂名称生产批号检验日期报告日期试验方法根据鲎试剂灵敏度的标示值（0.25EU/ML）,将细菌内毒素工作品稀释制备成0.50EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.0625EU/ml。取分装有0.1ml鲎试剂溶液原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃恒温器中，保温60分钟±2分钟。结果记录公式：λc=1g-1(∑X/4)计算：λc=结论复核人：检测人：干扰试验按表制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。Es=anti1g(∑Xs/4)Et=anti1g(∑Xt/4)式中，Xs、Xt分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值（1g）。当Es在0.5λ—2λ(包括0.5λ和2λ)及Et在0.5Es—2Es(包括0.5Es和2Es)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。凝胶法干扰试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液———2B2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444C2λ/检查用水检查用水1242λ1λ0.5λ44480.25λ4D无/检查用水———2注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列；D为阴性对照。可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的方法（如过滤、中和、透析或加热处理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。试验操作按表制备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。凝胶限度试验溶液的制备编号内毒素浓度/被加入内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液2B2λ/供试品溶液2C2λ/检查用水2D无/检查用水2注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阳性对照；D为阴性对照。结果判断保温60分钟±2分钟后观察结果。若阴性对照溶液D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。若溶液A的两个平行管均为阴性，判供试品符合规定；若溶液A的两个平行管均为阳性，判供试品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判供试品符合规定；否则判供试品不符合规定。细菌内毒素检验报告QR-71NO：共页第1页产品名称生产批号规格型号抽检数量批号检验日期灭菌批号报告日期检验依据GB/T14233.2-2005检验项目检验记录供试液制备抽检产品信息1．供试品数量：2．浸提介质：细菌内毒素检查用水。3.供试液制备:在无菌条件下，硅凝胶乳房假体、软组织扩张器壳体按表面积3cm2：1m浸没；凝胶、硅橡胶外科植入物取2g用检查用水浸没，密封，置37±1℃恒温箱保温2h，取出后将供试液至具塞玻璃容器内。供试液需在2小时内检测。细菌内毒素鲎试剂灵敏度：EU/ml样品:内毒素EU/ml阳性对照（内毒素）浓度EU/ml试管顺序鲎试剂(ml)内毒素(ml)检查用水(ml)检品（ml）结果1阳性对照23阴性对照456789101112结论