蓝白斑筛选原理

蓝白斑筛选原理蓝白斑筛选的原理分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷)pET载体中，目标基因克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7RNA聚合酶来诱导表达。Novagen的pET系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36种载体类型、15种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。优点·是原核蛋白表达引用最多的系统;·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低;·真正的调节表达水平的“变阻器”控制;·提供各种不同融合标签和表达系统配置·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌·许多载体以LIC载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR产物·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化pET系统概述pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier等开发的T7启动子驱动系统，Novagen的pET系统已用于表达成千上万种不同蛋白。控制基础表达水平宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7RNA聚合酶基因的宿主菌（λDE3溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3溶原菌中，T7RNA聚合酶基因由lacUV5启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS和pLyE时调控会更严紧。pLys质粒编码T7溶菌酶，它是T7RNA聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS宿主菌产生低量T7溶菌酶，而pLysE宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3溶原菌。有11种不同DE3溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon和ompT蛋白酶。B834菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35S-甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR为recA-衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶(trxB)突变菌株(AD494,BL21trxB)，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。OrigamiTM和OrigamiB菌株为trxB/gor双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami和OrigamiB宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的RosettaTM菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12菌株HMS174和NovaBlue，象BLR一样为recA-。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F附加体编码的高亲和力lacIq阻遏蛋白，NovaBlue为一个有用的严紧型宿主菌。此外，Novagen提供了λDE3溶原化试剂盒，用于制备其它遗传背景的新表达宿主菌。表达高毒性基因或制备新的λDE3溶原菌的另一替代方法是通过lCE6感染提供T7RNA聚合酶。虽然不如用IPTG诱导λDE3溶原菌方便，这种策略也被优先用于一些应用中。高严紧性T7lac启动子除了在宿主菌水平选择三种基本的表达严紧性，pET系统中T7启动子本身提供了两种不同的严紧性选择：普通T7启动子和T7lac启动子。T7lac启动子在启动子区下游17bp处含有一个25bp的lac操纵序列。该位点结合lac阻遏蛋白能够有效降低T7RNA聚合酶的转录，这样提供了在λDE3溶原菌中抑制基础表达的第二种基于lacI的机制（除了抑制lacUV5）。含T7lac启动子的pET质粒还具有它们自己的lacI，确保足够的阻遏蛋白结合到操纵基因位点上。控制诱导的表达水平在许多情况下，表达活性可溶性最好的蛋白依赖于宿主细胞的背景、培养条件和合适的载体配置。通常，目标蛋白活性最高的条件与产量最高的条件不一致。除了根据载体/宿主菌组合控制T7RNA聚合酶的基础表达提供不同严紧性，pET系统还根据诱导物（IPTG）浓度，对目标蛋白表达提供了真正的“变阻器”控制。Tuner和OrigamiB宿主菌的lacY突变使这种控制成为可能。PPT180pSUGV4大肠杆菌到枯草杆菌之间的克隆载体。pYES-DEST52invitrogen公司生产的，用于大肠杆菌到酿酒酵母之间的克隆载体，其中有乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶基因(URA3基因)，在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上可以生长。pBPV-BV1由大肠杆菌质粒载体和牛乳头瘤病毒构建而成的。既可在大肠杆菌细胞中复制，也可在动物细胞中复制，每个细胞平均拥有10-30个拷贝。pPIC9K(1)具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；(2)表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90%以上,有利于目的蛋白的分离纯化；(3)在简单合成培养基中可实现高密度培养；(4)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；(5)由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZαA，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115（AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法.easternblot:电驱动转移等电聚焦电泳后的蛋白区带biotting历史如下(来自电泳的原理应用及进展):转印电泳最先是由Southern于1975年发明的。在电流作用下，他成功地将DNA片段从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维膜上进行分子杂交分析，因此称为Southern-blotting。后来，Alwine用类似方法也成功地将RNA从电泳胶中转印到硝酸纤维膜上作分子杂交分析，但他并没有称这一技术为Alwine-blotting，而是称之为Northern-blotting，以便与Sourhernblotting相对应。1981年Burette又成功地将SDS-PAGE胶中的蛋白质转印到膜上进行免疫学分析（如抗原抗体结合、蛋白质与配基结合等），继之Alwine，Burette称这一技术为Western-blotting。这样一来，在转印电泳这个家族中，就有了Southernblotting，Northern-blotting和Western-blotting，仅仅缺一个Eastern-blotting。其实后来有人提议将IEF胶(即等电聚焦电泳)中的蛋白质转印到膜上的技术称为Eastern-blotting，但这一建议并未被广泛接受GlutathioneS-transferase(GST)谷胱甘肽巯基转移酶