绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析

石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析2摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP诱导不同时间的表达情况的检测方法。关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。1.2实验背景绿色荧光蛋白（greenfluorescentproteinGFP)是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。与以往lacZ、CAT等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性:GFP不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。正是由于GFP检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。同时也正因为其荧光反应不是酶反应，所以当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP的检测可能会产生一些假相，不易对荧光进行定量的测定。我们利用基因工程手段在大肠杆菌中高效的表达了GFP，制备出GFP抗体，利用抗原与抗体之间的特异性，在体外对GFP进行检测，可在一定程度上弥补上述GFP检测中可能出现的问题，可以作为一种重要的辅助手段用以提高GFP检测的灵敏度和准确度。原核表达是将克隆基因插入合适载体后导入大肠杆菌，用于表达大量蛋白质的方法。选用原核表达系统的原因是易于生长和控制、用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞培养的材料昂贵、有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析3特性的质粒可供选择。但是在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。包涵体是在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，形成被膜包裹的结构，具有水不溶性的特点。本实验主要是通过SDS-PAGE来检测绿色荧光的原核表达情况。1.3流程图：2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料质粒DNA;PCR产物、酶切质粒、DNAMarker;外源DNA片段：PCR扩增回收目的片段A和PGM-Tvector(Amp’,lacZ),带限制性内切酶末端的DNA溶液（目的片段A和载体片段pBL）;E.coliDH-5α受体菌（R-M-），自提的质粒或重组子;重组质粒DNA的菌落、BL21;重组GFP质粒、标准蛋白。2.1.2实验仪器PCR仪、PCR管、移液枪、离心机、电泳仪、涡旋振荡器、冰箱、透射仪、紫外透射仪、刀片、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液枪、Eppendorf管、高压灭菌锅、超净工作台、制冰机、振荡培养箱、移液器、摇床、酒精灯、培养皿、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、分光光度计。2.1.3实验试剂模板DNA、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物、Buffer(内含Mg2+)、ddH2O、pGM-T绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析4载体、T4DNA连接酶、限制性内切酶、DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒，其它生化试剂皆为国产分析纯。2.2实验方法2.2.1PCR扩增目的基因片段(1)依次混匀下列试剂，反应体系如下：PCR反应体系各成分的量ddH2O9.5l上游引物1.0l下游引物1.0l模板DNA1.0lTaqDNA聚合酶12.5lTotal25l混匀后瞬时离心(2)将PCR管放入PCR仪中，设定PCR仪的循环参数。预变性94℃3min，变性94℃30s，退火52℃30s，延伸72℃40s30个循环。总延伸72℃4min；温度时间预变性94℃3min变性94℃30S退火52℃30S延伸72℃40S总延伸72℃240S(3)PCR扩增完毕后，取出PCR管放在冰盒上；(4)取5l扩增后产物，进行琼脂糖电泳检测。2.2.2目的基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测（1）加20ml1×TAE缓冲液于三角瓶中；（2）精确称取0.2g琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化；（3）冷却至60℃左右，加1μl的Goldview溶液，摇匀；（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30分钟以上；（5）轻轻拔除梳子，将胶放入电泳槽中，加入电泳缓冲液（TAE），使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm；（6）取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混匀上样；（7）110v约电泳0.5～1小时；（8）紫外透射仪观察结果。2.2.3DNA的回收和纯化绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析5回收PCR产物（采用天根时代DNA回收试剂盒）:（1）用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来，分别放入1.5ml离心管中；（2）以0.1g凝胶对应300μl的体积加入PN;（3）50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解；（4）将上述的得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，12000rpm离心60s，弃掉废液；（5）加入700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；（6）加入500μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃掉废液；（7）将离心吸附柱放回收集管，12000rpm离心2min；（8）取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适当的洗脱缓冲液EB30μl，洗脱缓冲液先在65℃水浴预热，冷却至室温，12000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，12000rpm离心1min；（9）电泳检测回收产物，余置于-20℃下保存。透射仪观察结果，并拍照。2.2.4重组质粒的连接把PCR扩增的目的基因片段产物与pGM-T载体连接，反应体系如下：2.2.5大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备采用CaCl2法。（1）将实验室保存的E.coliDH-5α菌株甘油管用无菌去离子水1:100稀释后，平板划线法接种在无抗生素的LB固体培养基上，37℃培养过夜，见有菌落长出，用接种环从平板上挑取一个单菌落，接种到20ml无抗生素的新鲜LB液体培养基中，37℃、200rpm震荡培养过夜，活化E.coliDH-5α菌株；（2）按照1%接种量，从上述培养液中吸取菌液2ml，转瓶接入200ml新鲜的无抗生素的LB液体培养基中，37℃,200rpm震荡培养至OD600值为0.5左右；（3）在已灭菌的10ml离心管中吸取上述培养液10ml，冰水浴10min后，4℃、6000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；（4）加2ml冰冷预热的0.1mol/LCacl2溶液，重悬菌体，冰浴10min，4℃、体系成分体积(μL)ddH2O3.510×T4DNA1.0目的片段（回收）4.0pGM-T载体0.5T4DNAligase1.0Total10.0绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析66000rpm离心2min，收集菌体，弃上清；（5）将每一份沉淀轻缓地悬于0.4～1ml含有20%甘油的0.1mol/LCacl2的溶液中，轻轻重悬菌体沉淀，冰上放置10分钟；（6）分装100μL/管（冰浴分装），置于-70℃冰箱中保存。2.2.6连接产物转化感受态细胞(1)转化用固体LB培养基平板制备：向含100μg/ml氨苄青霉素（AMP）的固体LB培养基平板上加50mg/ml的IPTG16μl和20mg/ml的X-gal40μL，用灭菌弯头玻璃棒涂布均匀，37℃避光倒置3h，让溶解X-gal的二甲基甲酰胺尽量挥发干净。加入ITPG和X-gal的转化用平板应避光保存，以防试剂见光分解。（2）连接产物转化E.coliDH-5α感受态细胞：①取5μl连接产物加到100μlE.coliDH-5α感受态细胞中。轻弹混匀，水浴20min。②取出离心管，42℃水浴中热激90后，立即置冰浴中冷却5min。③向离心管中加入800μL37℃预热的无抗生素的LB液体培养基。④取出离心管，12000rpm离心2min，弃上清800μL，用剩余的约100μL上清将沉淀菌体吸打混匀后，在LB平板上涂布ITPG和X-gal。将平板倒置在37℃恒温箱中培养14h～18h，直至长出菌落，观察结果。2.2.7重组质粒的菌落鉴定本次实验所用的pGM-Tvector含Ampr、lacZ基因，所以有重组质粒的菌落为白色，没有重组质粒的菌落为蓝色。具体操作如下：①挑取菌落：使用无菌枪头随即挑取5个白色菌落，放入含氨苄青霉素的LB液体培养基的1.5mlEP管，振荡培养4h以上，吸取0.5ul菌液作为PCR反应模板，其余继续培养。②PCR反应体系与反应程序均与目的基因扩增条件一致。③扩增产物取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。2.2.8提取重组质粒将鉴定为阳性重组子的质粒EP管挑取出来，按照实验室提取质粒的试剂盒说明书操作。提取后，取5ul用1%琼脂糖凝胶进行检测。2.2.9重组质粒双酶切用限制性内切核酸酶BamHⅠ和SalⅠ对PCR阳性菌落提取的质粒做双酶切鉴定。酶切反应体系如下表。体系成分体积质粒5.0ul绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析7去离子水11ul10×BufferT3.0ulBamHⅠ（120U/ul）0.5ulSalⅠ(100U/ul)0.5ul总体积20ul37℃酶切过夜，70℃灭活酶活性。1%琼脂糖凝胶进行检测。2.2.10GFP基因重组表达质粒及诱导表达（1）将上步经酶切鉴定得到的GFP目的片段与表达质粒连接，并转化至大肠杆菌BL21菌株。转化菌涂布于含有卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养；（2）观察菌落生长情况，进行菌落PCR鉴定；（3）将鉴定为阳性的菌落接种于20ml含50mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌培养过夜。（4）按1:100稀释过夜菌，接种于100ml含有卡那霉素的LB培养基中，37℃摇菌继续培养至A600约为0.4-0.8。（5）取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为1mmol/L，于37℃诱导表达。每隔1h分别取菌体1ml，离心12000g，30s得到沉淀，观察蛋白表达情况。2.2.11SDS-PAGE检测诱导表达的蛋白（1）取未诱导、诱导不同时间的培养物500ul于微量离心管中，室温高速离心1min。沉淀悬浮于100ul1×SDS凝胶加样缓冲液中，100℃加热3min，室温高速离心1min后，冰上放置。（2）安装电泳装置，配制12%分离胶倒入凝胶槽，加蒸馏水密封。待凝固后再倒入5%浓缩胶，插上梳子。待凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中，上样，电泳。（3）电泳结束后，将凝胶浸泡在染色液中，室温在摇床上缓慢染色4h。（4）脱染：将染液回收，凝胶先用蒸馏水漂洗一次后侵入脱染液中脱染，更换几次脱色液，直至出现清晰的电泳带。（5）脱色后，将凝胶保存在水中或是含20%甘油的水中；（6）观察实验结果。3结果与分析3.1PCR扩增目的基因片段的