植物细胞大规模培养

第十二章植物细胞大规模培养教学内容1、植物细胞培养基2、植物细胞培养方法3、植物细胞的大规模培养技术4、影响植物细胞培养的因素5、植物细胞培养反应器前言植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过2万种，而且还在以每年新发现1600种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已各积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时珍（1953）编纂的巨著《本草纲目》中所开列的1892种药物绝大多数是植物。目前仍约25%的法定药品来自植物。然而植物生长缦慢，自然灾害频繁。即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。因此早在1956年，Routier和Nickell就提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。第十二章植物细胞的大规模培养中草药Reinhard等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。紧接着Kaul等（1969）、Furrya等(1972)和Teuscher等（1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣(yu山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）。现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达2万升（20吨）。我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。鉴于有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足需要。采用大规模植物细胞培养技术就可以直接生产这些产物。如可作为药物和染料的紫草宁就是典型的通过大规模植物细胞培养生产的产品，通过大规模培养紫草细胞短时间内就可大量生产紫草宁。表12-1是植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较。表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较生产方式收获时间紫草宁浓度（%干重）完整植物2-3a1-2植物细胞培养21d14目前，植物细胞培养技术已在农业、医药、食品、化妆品、香料等领域广泛用于大规模生产有价值的产品。小规模的细胞培养通常在培养瓶中完成，而大规模的培养可在发酵罐中进行。问题请列举出3至5种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）与动物细胞培养相比，植物细胞培养的最大优点是植物细胞可以在简单的合成培养基上正常生长。用于植物细胞培养的基础培养基成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基需要满足各自的特殊要求。根据特定的植物种类和培养系统，培养基的基本营养成分可作适当的调整。一、植物细胞培养基植物细胞培养基通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素和有机添加剂等。无机盐类包括：无机盐浓度一般为多少？微量元素主要包括碘、硼、锰、锌、钼、铜、钴、铁等。碳源和能源P225维生素植物细胞的生长都需要硫胺素。可在植物细胞培养基中加入烟酸、吡哆醇、泛酸、生物素和叶酸等。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。1、植物细胞培养基的组成植物生长激素大多数植物细胞培养基中都含有天然的或合成的植物生长激素。生长激素包括了植物生长素、细胞激动素、赤霉素和脱落酸等四大类。有机氮源通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。P225有机酸加入丙酮酸，或者柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等三羟酸循环的中间产物，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且使细胞对钾盐的耐受能力至少提高到10mmol/l。除此之外，这些有机酸还能提高低密度接种的细胞和原生质体的生长。复合物质在植物细胞的培养过程中，酶母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁等复合物质通常可以作为细胞的生长剂。目前应用最广的基础培养基主要有MS、B5、E1以及N6培养基。表12-2列出了这几种常用的植物细胞培养基。1、植物细胞培养基组成包括等。问题2、植物生长素、细胞激动素、赤霉素对植物细胞培养上有何作用？2、植物细胞培养基的制备制备培养基时，培养基中使用无机盐、碳源、维生素、有机酸和植物生物激素都应该采用最高纯度级的试剂和药品。有些生长激素在使用前需要进行重结晶提纯。由于一些生长激素难溶于水，配制时可先溶于2-5ml的酒精中，其酒精-水溶液要用吸附法进行脱色处理，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热后，再稀释至所需体积。配制培养基的用水应严格地采用蒸馏水或高纯度的去离子水，其中以玻璃器皿制备的蒸馏水最好。培养基的PH值应用0.5m0l.l-1的HCL或0.2m0l.l-1的NaOH进行调节。当需要使用固体培养基时，须加入琼脂。配制好的培养基按要求装入三角瓶或试管中，121下灭菌20min，待冷却后就可以使用。对于一些热敏性化合物，如L-谷氨酰胺、植物生长激素等，灭菌时不可采用加热法，而应该采用过滤法灭菌，然后无菌操作加入到已灭菌的培养基中。植物细胞培养基的制备是非常严格的植物细胞培养基制备时对水有哪些严格要求？问题由于培养基中的组份种类繁多，且一些组份量很小，配制起来很繁锁，因此往往把培养基配制成使用浓度的10或100倍的母液，使用时再按需要稀释至使用浓度。培养基母液或经稀释后的培养基应置于冰箱内，在10度以下保存待用。一般含有有机物或激素类物质的培养基母液或稀释液最好保存时间不超过十天。在培养基配制过程中需要注意的是，为了防止在高浓度下，培养基份间相互作用产生沉淀，诸如CaCL2、KI、EDTA的钠或亚铁盐需要单独配制保存，使用时再稀释混合。二、植物细胞培养方法原生质体培养：植物的体细胞（二倍体细胞）经过纤维素酶处理后可去掉细胞壁，获得的去壁细胞称为原生质体。该原生质体在良好的无菌培养基中可以生长、分裂，最后可以长成植株。实际过程中，可以用不同植物的原生质体进行融合与体细胞杂交，由此可获得体细胞杂交的植株。植物因受创伤而在伤口附近产生的薄壁组织植物细胞培养方法主要有———————————————————————---------------------------等。单倍体细胞培养：主要用花药在人工培养基上进行培养，可以从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或者是通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。固体培养：固体培养是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。固体培养基的凝固剂除特殊研究外，几乎都使用琼脂，浓度一般为6%-10%。接种材料放在培养基上，原生质体固体培养则需混入培养基内进行嵌合培养，或者使原生质体在固体-液体之间进行双相培养。液体培养：液体培养也是在微生物培养的基础上发展起来的植物细胞培养方法。液体培养可分为静止培养和振荡培养等两类。静止培养不需要任何设备，适合于某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床或转床等设备使培养物和培养基保持充分混和以利于气体交换。悬浮培养：（主要）植物细胞的悬浮培养是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。在进行细胞培养时，需要提供容易破裂的愈伤组织进行液体振荡培养，愈伤组织经过悬浮培养可以产生比较纯一的单细胞。用于悬浮培养的愈伤组织应该是易碎的，这样在液体培养条件下能获得分散的单细胞，而紧密不易碎的愈伤组织就不能达到上述目的。固定化培养主要固定化培养是在微生物和酶的固定化培养基础上发展起来的植物细胞培养方法。该法与固定化酶或微生物细胞类似，应用最广泛的、能够保持细胞活性的固定化方法是将细胞包埋于海藻酸盐或卡拉胶中。三、植物细胞的大规模培养技术目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。1、植物细胞的大规模悬浮培养前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。1953年Muir成功地对烟草和直立万寿菊的愈伤组织进行了悬浮培养。继之Tulecke和Nickell（1959）推出了一个20L的植物细胞封闭式悬浮培养系统。经蒸汽灭菌后接入目的培养物，以无菌压缩空气进行搅拌。当营养耗尽，细胞数目不再增加且次生物质达一定含量时，收获细胞，提取产物。他们用此系统成功地培养了银杏、冬青、黑麦草和蔷薇等细胞。结构简单，易于操作是本系统的突出优点。但它的生产效率不够高，次生物质累积的量也较少。阅读课本P228-23010分钟悬浮培养中的植物细胞的特性由于植物细胞有其自身的特性，尽管人们已经在各种微生物反应器中成功地进行了植物细胞的培养，但是植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养是不同的。植物细胞培养液的流变特性1、在悬浮培养时，植物细胞是以单一存在还是以细胞团形式存在？问题2、植物细胞以细胞团形式存在存在原因？3、人们常用粘度这一参数来描述植物细胞培养液的流变学特征，培养液粘度的变化主要是由于什么引起，而不是分泌物引起？植物细胞培养过程中的氧传递由上述情况可以看出，氧对植物细胞的生长来说是很重要的，但是CO2的含量水平对细胞的生长同样相当重要。研究发现，植物细胞能非光合地固定一定浓度的CO2，如在空气中混以2%-4%的CO2能够消除高通气速率对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。因此，对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时，CO2和氧气的浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长，所以植物细胞培养有时间需要通入一定量的CO2等气体。把课本的两句话划线4、说说过高的通气速率对植物细胞的生长不利原因？5、植物细胞培养时为什么有时要通入一定量的CO2气体？泡沫和表面粘附性6、植物细胞培养时产生的泡沫有何特点？悬浮细胞的生长与增殖悬浮培养时细胞的生长曲线如图12-1所示，细胞数量随着时间的变化曲线呈现S形。在细胞接种到培养基中最初的时间内细胞很少分裂，经历一个延迟期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是细胞增殖减慢的的减慢期和停止生长的静止期。整个周期经历时间的长短植物种类和起培养细胞密度的不同而不同。在细胞培养过程中，一般在静止期或静止期前后进行继代培养，具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。图12-1悬浮培养时细胞的生长曲线0培养时间（d）细胞数静止期减慢期直线生长期对数生长期延滞期由于悬浮培养具有：增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；可带走培养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢产物局部浓度过高等问题；保证氧的充分供给等三个基本优点，使悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。细胞团和愈伤组织的再形成和植株的再生悬浮培养的单个细胞在3-5d内即可见细胞分裂，经过一星期左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂而形成肉眼可见的小细胞团。大约培养两周后，将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上，连续光照，三星期后可分化出试管苗。表12-1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较生产方式收获时间紫草宁浓度（%干重）完整植物2-3a1-2植物细胞培养21d14紫杉醇是近年发现的重要的抗癌药物，能有效地治疗卵巢癌、乳腺癌等妇科癌症。但由于紫杉醇是从珍稀植物紫杉提取的，所以如何得到充足的药物一直是医学和环境学家争论的问题。紫杉醇的生产只能通过大量的砍伐这种珍稀植物，这显然将对环境产生不良影响。所以目前科学家们正在开展紫杉醇细胞培养法进行生产和研究。我国在“八五”、“九五”和“863计划”中连续拨款资助工业化培养和生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，目前已达到60mg/L的世界先进水平。复习请列举出3至5种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。紫草宁抗肿瘤药物紫杉醇薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）2、植物细胞或原生质体的固定化培养由于固定化植物细胞培养比自由悬浮细胞培养具有较高的机械稳定性、产率，更长的稳定（生产期）等许多优点，因此，通常采用固定化来进