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上课了！！第四章植物细胞（组织）和动物细胞培养反应器第一节植物细胞（组织）培养反应器一。植物细胞培养过程的特点二。植物细胞培养反应器三。植物组织培养及反应器第二节动物细胞培养反应器一。动物细胞培养法二。细胞培养的操作方式三。动物细胞大规模培养反应器四。动物细胞大规模培养技术的应用第三节微藻培养反应器一。微藻生物技术的优越性二。微藻大规模培养的特点三。微藻大规模培养反应器前言：进行植物细胞培养技术研究的原因：一）植物是人类赖以生存的前提是人类食物，药品，香料，色素的来源二）人口过度增长和对植物药的掠夺造成植物药天然资源的匮乏植物细胞培养技术可解决植物细胞培养周期长的矛盾广义的植物细胞培养技术包括：植物器官（根，枝叶，发根，胚和冠缨组织等），组织，细胞和原生质培养，并以此发展起来的各种组织细胞培养技术植物细胞培养反应器的研制将和不同植物的不同生理，代谢方式相关，不同培养方式相关GottleibHaberlandt•1902年德国植物学家Haberlandt在营养液中成功地培育了单个植物细胞，尽管未能使其分裂生长，但为植物细胞培养翻开了新的一页。•Haberlandt提出植物细胞的“全能性”学说，植物细胞的全能性：植物的体细胞具有母体植株全部遗传信息并发育成为完整个体的潜力，因而每一个植物细胞可以像胚胎细胞那样，经离体培养再生成植株。1。植物细胞培养液的性质植物细胞比微生物细胞要大很多烟草细胞比微生物细胞要大50~100倍细胞体积大约膨大105~106倍细胞在培养液中体积将膨大40%~50%细胞培养时，细胞形态将发生明显变化间歇培养的初期，多半是较大的游离细胞再由较大的细胞分裂成一个个较小的细胞较小的细胞聚集成细胞块生长停止后，细胞伸长，涨大，块状细胞游离分散植物细胞培养液黏度随细胞浓度增加而显著上升剪切应力和剪切速率之间的关系如下：式中：M---转矩k—粘度系数a---常数W----旋转黏度计转子的转速n---流动指数例子：烟草细胞培养条件为30L反应器（装液量22L）转速50r/min通气量17L/min，定时测培养液的粘度，发现n=0.67~0.74说明：该发酵液为拟朔性流体，非牛顿流体k值随培养过程缓慢增加，但不一定与细胞量成比例2。植物细胞培养中的传递状态在植物细胞培养过程中，氧的供应和传递也将影响产物的有效生产和良好的经济效益通常植物细胞对氧的需求量要低很多，kla值过大对细胞增殖未必有什么好处nkwM原因：kla值过大，氧传递速率过高，使培养细胞的主要挥发性代谢产物，如CO2被强制性除去而降低了细胞的增殖速度。从而导致细胞浓度降低。在kla值高的操作条件下通入一定量的CO2对细胞量的增大是有效的植物细胞培养采用：悬浮培养固定化细胞培养系统悬浮培养所用生物反应器：机械搅拌反应器非机械搅拌反应器固定化细胞培养反应器：填充床反应器流化床反应器膜反应器1。悬浮培养生物反应器1）机械搅拌式反应器StirredTankBioreactors植物细胞培养反应器机械搅拌式反应器优点：混合性能好传氧效率高操作弹性大可用于细胞高密度培养；缺点：剪切力大。悬浮培养生物反应器优点：采用机械搅拌能使溶质均匀混合获得较高的kla(100h-1)，植物细胞培养所需的kla值一般为5~20h-1存在问题：植物细胞壁对剪切的耐受能力差解决办法：适当改进的搅拌式反应器1）Tanaka认为浆形板搅拌器既能满足细胞溶氧又能满足剪切要求2）Kreis认为平叶形搅拌器加挡板与气升式反应器相当3）大叶形，螺旋形等也有成功使用的报道4）对细胞在搅拌式反应器上的长期驯化，能使细胞对剪切的耐受能力大大提高2）非机械搅拌式反应器--------气体搅拌式反应器利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器植物细胞培养反应器机械搅拌式反应器分类：鼓泡式反应器和气升式反应器气升式反应器又分为：内循环和外循环两种形式气升式反应器的特性：流体动力学特性对kla的影响较小氧传递系数的变化主要取决于单位体积气液表面积气液表面积又取决于气泡的大小和总气体持有量影响气泡大小的因素：气体分布器设计，流型培养基的聚集抑促特性气体持有量是气体占有体积与反应器总体积的分率常与界面气体速率有关，增加气体流速便增加了气体持有量和kla但气体流速等问题受到泡沫等问题的限制，可通过改进反应器内部结构以促进氧传递非搅拌式反应器所产生的剪切力较小，结构简单。其主要类型有鼓泡式反应器、气升式反应器等气体搅拌式反应器植物细胞培养反应器非机械搅拌式反应器↑↑↑↑↑↑↑AirinletGasoutlet→CulturemediumSieveplateBubbleColumnBioreactor植物细胞培养反应器非机械搅拌式反应器Air-liftBioreactor缺点：搅拌强度较低时将影响培养物的混合，需大量通气输入动量和能量。但过量的通气将易于驱除培养液中的CO2和乙烯，且过高溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利鼓泡式反应器的氧传递能力一般较大气升式反应器因流体不断循环而混合效果最佳2。固定化细胞生物反应器固定化植物细胞培养的优点：1）可克服植物细胞培养中细胞遗传和生理的高度不稳定性2）防止因为细胞间的不一致性，而造成的在培养过程中的高产细胞系出现的低产率和产生其他代谢产物的情况3）有利于消除和减弱流质流动所引起的切变力4）细胞在一个限定的范围内生长可导致一定程度的分化发育，促进次级代谢产物的产生植物细胞培养反应器固定化细胞生物反应器填充床反应器流化床反应器→↑进口出口1）填充床反应器细胞固定于支持物表面和内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层中流动缺点：1）床中单位体积细胞较多，混合效果不好2）床内氧的传递，气体排出，温度和PH控制较为困难。3）支持物颗粒破碎还易使填充床堵塞2）流化床反应器利用流体（液体或气体）的能量使支持物颗粒处于悬浮状态优点：混合效果好缺点：流体的切变力和固定化颗粒的碰撞常使支持物颗粒破碎，流体动力学的复杂使其放大困难3）膜反应器采用一定孔径和选择透性的膜固定植物细胞植物细胞培养反应器流化床反应器植物细胞培养反应器流化床反应器流化床反应器示意图：营养物质可通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次级代谢物可通过膜释放到培养液中膜反应器包括：中空纤维反应器螺旋卷绕反应器在中空纤维反应器中，细胞保留在装有中空纤维的管中螺旋卷绕反应器是将固定有细胞的膜卷绕成圆柱状膜反应器的优点：膜反应器的操作压下降较低流体动力学易于控制，易于放大能提供更均匀的环境条件可进行产物分离以解除产物的反馈抑制3。植物细胞反应器的放大在植物细胞培养反应器的放大过程可以体积氧传递系数kla为依据，同时考虑合理的搅拌强度（搅拌强度对反应器的放大影响很大）在反应器的放大过程中需充分了解大型反应器内流体流动，传质传热规律植物细胞培养反应器固定化细胞膜反应器中空纤维螺旋卷绕反应器利用“优势互补”原则，将两种反应器结合起来研究出组合式反应器。带有低速搅拌的气升式发酵罐可弥补低气速时混合性差的弱点。植物细胞培养反应器组合式反应器光生物反应器植物组织培养反应器发状根大规模培养↑10541287693植物组织培养反应器小植物的大规模快速繁殖浅层循环式植株快速繁殖器双层板径向流生物反应器植物组织培养反应器小植物的大规模快速繁殖内环喷雾生物反应器↑进气排气植物细胞培养反应器紫草细胞培养紫草种子无菌幼根LS培养基愈伤组织诱导培养悬浮细胞悬浮培养细胞增殖培养一级培养植物细胞培养的应用西洋参细胞培养无菌根愈伤组织悬浮细胞发酵液乙醇消毒诱导培养悬浮培养大量培养西洋参根细胞过滤西洋参细胞干粉成品干燥植物细胞的生产药物的生产植物细胞产物产物作用紫草细胞紫草宁抗炎剂、食用色素苦瓜细胞类胰岛素治疗糖尿病长春花细胞长春花碱治疗白血病药红豆杉细胞紫杉醇抗癌药物毛地黄细胞毛地黄毒素强心剂植物细胞培养的应用紫草种子无菌幼根愈伤组织悬浮细胞细胞增殖培养LS培养基诱导培养悬浮培养一级培养产物培养二级培养发酵液细胞收集过滤产物提取分离成品干燥紫草细胞培养生产紫草宁(Shikonin)代谢产物的生产动物细胞培养可生产的生物制品1.病毒疫苗：口蹄疫(FMD)、狂犬疫苗等2.非抗体免疫调节剂：干扰素(IFN)、白介素(IL)等3.多肽生长因子：神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)4.酶：组织血纤维溶酶原激活剂(t-PA)5.激素：红细胞生成素(EPO)、促黄体生成素(LH)6.病毒杀虫剂7.肿瘤特异性抗原：癌胚抗原(CEA)8.单克隆抗体9.皮肤重植10.细胞动物细胞培养技术的应用动物细胞培养所涉及的领域：病毒疫苗，干扰素，诊断试剂，治疗蛋白，生物杀虫剂兴起的原因：基因工程和杂交瘤技术的迅速发展基因工程可使外源蛋白基因转入动物细胞并大量扩增杂交瘤技术可使各种单克隆抗体通过杂交瘤细胞分泌产生优点：产物具有转录后修饰及胞外分泌的特点动物细胞培养装置包括：气升式深层培养系统微载体培养系统微囊培养系统大载体培养系统中空纤维培养系统动物细胞融合杂交瘤技术体外培养的动物细胞类型：一。非贴壁依赖性细胞：来源于血液。淋巴组织的细胞，肿瘤细胞和某些转化细胞二。贴壁依赖型细胞：大多数动物细胞，非淋巴组织的细胞，异倍体的细胞贴壁依赖性细胞需要附着于待适量正电荷的固体或半固体表面上生长1。贴壁培养：成纤维细胞和上皮细胞培养方式：滚瓶系统，微载体系统2。悬浮培养：非贴壁依赖性细胞：杂交瘤细胞等细胞在培养器中自由悬浮生长培养方式：转瓶或滚瓶培养，发酵罐3。固定化培养：适合于两种细胞，非贴壁依赖性细胞用海藻酸钙包埋。贴壁依赖性细胞用胶原包埋优点：细胞生长密度大抗剪切力抗污染能力强就操作方式而言：深层培养可分为分批式，流加式，半连续式，灌注式1。分批式操作：将细胞和培养液一次装入反应器内培养，细胞不断生长，产物不断形成，经过一段时间反应后，将整个系统取出A。在分批式发酵过程中细胞生长的环境在不断变化B。细胞所处环境并非最优细胞生长可分为：延迟期对数生长期减速期平稳期衰退期2。流加式培养定义：将一定量的培养液装入反应器，在适宜条件下接种细胞，进行培养，细胞不断生长，产物也不断形成，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分不断补充至反应器内，使细胞进一步代谢。到反应终止时取出整个反应系特点：1。能够调节环境中营养物质的浓度1）避免某种营养成分初始浓度过高而出现的底物抑制现象2）能防止限制性营养成分被消耗而影响细胞的生长和产物的形成2。由于新鲜培养液的加入，整个过程中反应体积是变化的根据流加方式的不同可分为：无反馈控制流加有反馈控制流加无反馈控制流加包括：定流量流加间断流加有反馈控制流加是：连续或间断的测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标，来调节流加速度和流加液中营养物质的浓度3。半连续式流加又称反复分批式培养或换液培养在分批培养的基础上，不全部取出反应系，剩余部分重新补充新的营养成分，再按分批式操作的方式进行培养特点：反应器内培养液的总体积保持不变适用于基因工程动物细胞分泌有用产物和病毒培养4。连续操作适用于培养非贴壁依赖性细胞将细胞种子和培养液一起加入反应器中进行培养。一方面新鲜培养液不断加入反应器中。另一方面将反应液连续不断的取出，使反应条件处于一种恒定状态优点：细胞所处环境状态可长期保持稳定可研究细胞生理和代谢规律能连续不断的收获产物，且提高细胞密度5。灌注培养指细胞接种后，一方面新鲜培养液不断加入反应器，另一方面反应液连续不断的取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态•流加式操作•半连续式操作细胞培养的操作方式能够调节培养环境中营养物质的浓度。•连续操作能提高细胞密度，应用于培养悬浮型细胞。•灌注培养大大提