第三章-消毒与灭菌

第三章消毒与灭菌1．灭菌：应用物理或化学方法杀灭物体中所有的病原微生物、非病原微生物以及芽胞和霉菌孢子的方法。2．消毒：应用物理或化学方法杀灭物体中的病原微生物，而对非病原微生物及芽胞，孢子不要求全部杀死。3．防腐：应用物理或化学方法阻止和抑制微生物的生长繁殖的方法。4．无菌操作法：防止或杜绝一切细菌进入动物体或其他物体的方法。5．滤过除菌：液体或气体通过滤过作用除去其中所存在的细菌。一般用0.22微米滤膜，但不能除去病毒，霉形体及L型细菌。介绍几个基本概念第一节物理因素温度干燥渗透压辐射过滤其他物理因素一、温度（一）高温对微生物的影响高温对微生物有明显的致死作用，其主要原因是高温能使菌体蛋白质变性或凝固，酶失去活性，核酸结构遭到破坏等，从而导致其死亡。多数细菌，酵母菌和霉菌的营养细胞和病毒在50-65ºＣ10min可以致死。细菌芽孢，在121ºＣ下５－20min才能致死，同种微生物老龄菌比幼菌耐热。干热灭菌(dryheatsterilization)焚烧灭菌法：常用于废弃物动物尸体等处理。烧灼灭菌法：是直接火焰灭菌，如接种环灭菌。烘烤灭菌法；实验室用干燥箱烘。一般是160℃2小时即可达到灭菌目的。湿热灭菌(mosistheatsterilization)在同温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好；因为：a比干热更易使菌体蛋白凝固。b湿热穿透力强；c湿热可以释放大量潜热。湿热灭菌法A.高压蒸汽灭菌法B.煮沸消毒法C.流通蒸汽消毒法D.间歇蒸汽灭菌法E.巴氏消毒法A.高压蒸汽灭菌法是湿热灭菌中最好的方法，通常1.05kg/cm2,的压力下面（此时温度121ºＣ）处理15－30min。要排冷空气，否则会形成假压力，虽然压力达到要求，温度却达不到相应温度，而影响灭菌效果。B、煮沸消毒法物品在水中煮沸15min，可杀死所有营养细胞和一部分芽孢。在水中加入１％的Ｎa2CO3或２－５％的石碳酸效果更好。此法适合注射器和解剖用具的消毒。C、间歇灭菌法(fractionalsterilization）a)是用常压蒸汽反复几次进行灭菌的方法。b)主要用于不宜高压灭菌的培养基，不耐热的药物和营养物等c)方法是将待灭菌物品置于蒸锅内加热到沸腾维持15-30min杀死营养细胞，取出冷却后在37℃恒温培养24小时，使芽孢萌发，再用此法灭菌，反复三次，即可达到灭菌目的。D、巴氏消毒法(pasteurization)a)是食品（牛奶）酿造（啤酒）工业中常用的方法。b)具体做法是63－65℃处理30min或71～72℃度处理15s,速冷却至10℃下。c)这样即可杀死病原微生物。又不致损坏营养，可保留食品饮料原有风味。d)为节省时间，又达到巴氏消毒的效果，现多用高温瞬时灭菌132℃下1-2s。（二）低温对微生物的影响①常温冰箱保存细菌和病毒：（细菌4～0℃；病毒－20℃～－70℃）。②低温保存食品应迅速冷冻，否则扰乱细胞胶体状态，使水分形成结晶，冰结晶还能机械地刺伤菌体胞膜，胞壁。③冷冻真空干燥法：采取迅速冷冻和抽真空除水原理；如冻干疫苗和冻干菌种。二、干燥水分是微生物的正常生命活动必不可少的。干燥会导致细胞失水而造成代谢停止以致死亡。微生物的种类，环境条件，干燥的程度等均影响对微生物杀灭的效果。休眠孢子抗干燥能力也很强，在干燥条件下可长期不死，这一特性已用于菌种保藏，如用砂土管来保藏有孢子的菌种。在日常生活中也常用烘干、晒干和熏干等方法来保存食物。三、渗透压细菌处于低渗液中，细胞会吸水膨胀乃至破裂，称胞浆压出。细胞处于高渗液中会脱水，引起细胞质和细胞壁分离，称质壁分离，导致死亡。等渗溶液对微生物生长有利四、辐射辐射是能量通过空间传递的一种物理现象。可见光线肉眼可见的光线是在红外线和紫外线之间，波长为400～800nm。日光利用日光暴晒是常用的简易消毒方法，许多细菌繁殖体在日光直射下2h很易死亡。紫外线：杀菌机理：波长200～300m的紫外线具有杀菌作用干扰DNA的复制与转录紫外线穿透力较弱不耐热物品的表面消毒应用范围：特点：杀菌机理：应用范围：电离辐射：包括高速电子、x射线和γ射线。产生游离基,破坏DNA。一次性医用塑料制品的消毒，食品的消毒不破坏其营养成分。五、滤过除菌法滤菌器:用物理阻留的方法，将液体或空气中的细菌除去,以达到除菌目的。含有微细小孔0.22微米,只允许液体或气体通过，而大于孔径的细菌等颗粒不能通过。适用范围：血清、毒素、抗生素以及空气等的除菌。滤菌器六、其他物理因素超声波超声波是由超声波发生器产生的，对细胞有破坏作用，能使大多数细胞裂解死亡。微波微波是一种波长短而频率较高的电磁波。微波对微生物的杀菌作用，主要是由于微生物在微波电磁场作用下，吸收微波的能量而产生热效应所致。第二节化学因素各种消毒剂可按其作用水平分为3类：（1）高效消毒剂：可以杀灭一切微生物，包括细菌繁殖体、细菌芽孢、结核杆菌、真菌和病毒等。这类消毒剂又称为灭菌剂。如甲醛、戊二醛、过氧乙酸和环氧乙烷等。（2）中效消毒剂除细菌芽孢外，可杀灭各种微生物。如乙醇、酚、含氯消毒剂和碘消毒剂等。（3）低效消毒剂可杀灭细菌繁殖体、真菌和有囊膜病毒，但不能杀灭细菌芽孢、结核杆菌和无囊膜病毒。如新洁尔灭、洗必太等。一、常用消毒剂的实用性能见下表消毒剂类别名称浓度(%)用途重金属盐红汞2皮肤、粘膜、小创面消毒硫柳汞0.01生物制品防腐氧化剂高锰酸钾0.1皮肤、尿道、水果、蔬菜消毒过氧化氢3皮肤、粘膜、创伤消毒过氧乙酸0.2～0.5塑料、玻璃、人造纤维消毒卤素类碘液2.5皮肤消毒醇类乙醇70～75皮肤、体温计消毒酚类石炭酸3～5地面、器皿表面和排泄物消毒来苏尔3～5同上、也常用于手及皮肤消毒表面活性剂新洁尔灭0.1手术器械消毒酸碱类生石灰10～20排泄物、地面消毒染料龙胆紫2～4表浅创伤消毒二、影响消毒剂作用的因素消毒剂的性质消毒剂的浓度与作用时间微生物的类型及数量环境中有机物的存在三、选择适当的消毒剂杀菌谱广、有效浓度低、作用快。性质稳定、易溶于水、不易受酸碱影响。无腐蚀性、无毒；不易残留。价格低、便于运输，可长期保存。第三节生物因素共生：两种或多种生物生活在一起时，彼此并不损害而相互有利，称为共生。寄生：一种生物从另一种生物获得所需的营养，赖以为生，并对后者呈现伤害作用者，称为寄生。拮抗：当两种微生物生活在一起时，一种微生物能抑制或杀死另一种微生物，此现象称为拮抗。协同：两种或多种生物在同一环境中，互相协助，共同完成某种作用，而为其任何一种所不能单独达到。一、抗生素与细菌素（一）抗生素是某些微生物在代谢过程中产生的能抑制或杀灭其他微生物的一种化学物质。它主要来源于放线菌、某些真菌和细菌等。抗生素的作用机理：a.干扰细菌细胞壁的合成b.影响细胞膜的通透性c.阻碍菌体蛋白质的合成d.改变核酸代谢（二）细菌素大肠杆菌产生的细菌素称大肠菌素；葡萄球菌产生的称葡萄球菌素；霍乱弧菌产生的称弧菌素等，每类细菌素又可分为不同的型别；细菌素仅对近缘细菌有作用。1928年A.Fleming发现青霉素澳大利亚病理学家霍华德.弗罗里与弗莱明1940提纯出青霉素。共同获得1945年诺贝尔生理学和医学奖.三、噬菌体病毒种类很多，根据病毒寄生的对象来分，有植物病毒、动物病毒和微生物病毒。噬菌体：是病毒中的一种，一般把侵染细菌、放线菌的病毒叫噬菌体。（把侵染真菌的病毒叫噬真菌体）噬菌体在自然界广泛存在，在1995年发表的ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种，分别划归为49个病毒科.据Bradley(1967)归纳，噬菌体共有六类形态。1、组成：主要由蛋白质和核酸组成。2、基本形态：蝌蚪形、微球形和纤丝形。（一）噬菌体的形态结构与组成以大肠杆菌T4噬菌体为例头部：廿面体对称结构，由蛋白质衣壳构成，内含一条DNA。颈部：薄盘状，附颈须。尾鞘：长95nm,衣壳粒螺旋对称；可伸缩。尾髓:中空，DNA可由此进入细胞。基板:六角形盘状物，其上有刺突、尾丝。刺突:有吸附功能。尾丝:有识别吸附功能。大肠杆菌T4噬菌体构造3、蝌蚪形噬菌体的构造（二）、噬菌体(phage)的繁殖噬菌体并没有个体的生长过程，而只有其基本成分的合成和装配，即首先将各个部件合成出来，然后装配，所以一般将噬菌体的繁殖称做复制。根据噬菌体与宿主的关系：烈性噬菌体：指感染宿主细胞后，能够使宿主细胞裂解的噬菌体.温和噬菌体（或溶源性噬菌体）：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。烈性噬菌体的繁殖过程一般分为五个阶段：即吸附、侵入、复制、装配和释放。1、烈性噬菌体的繁殖①吸附：噬菌体和宿主细胞上的特异性吸附部位进行特异性结合，噬菌体以尾丝牢固吸附在受体上后，靠刺突“钉”在细胞表面上。②侵入：核酸注入细胞的过程。噬菌体尾部所含酶类物质可使细胞壁产生一些小孔，然后尾鞘收缩，尾髓刺入细胞壁，并将核酸注入细胞内，蛋白质外壳留在细胞外。③复制：包括核酸的复制和蛋白质合成。噬菌体核酸进入宿主细胞后，会控制宿主细胞的合成系统，然后以噬菌体核酸中的指令合成噬菌体所需的核酸和蛋白质。④装配：主要步骤有：DNA分子的缩合——通过衣壳包裹DNA而形成头部——尾丝及尾部的其它部件独立装配完成——头部与尾部相结合——最后装上尾丝，至此，一个个成熟的形状、大小相同的噬菌体装配完成。⑤释放：方式：裂解：多以裂解细胞的方式释放。分泌：噬菌体穿出细胞，细胞并不裂解。通常情况下，一个噬菌体通过上述五个过程能合成100——300个噬菌体。烈性噬菌体的这种生长繁殖方式也称为一步生长，一步生长曲线1.实验设计依据：1个菌体被1个噬菌体感染,避免二次吸附；细菌群体被噬菌体同步感染。2.实验过程:敏感菌10mlPhage1ml混匀，5min,使之吸附离心或用抗phage血清处理,去除过量phage高倍稀释,吸附phage的菌悬液(避免多次吸附)37℃培养,定时取样取样人为裂解处理（每5min）样品中加入氯仿裂解细胞24-48h裂解液加入敏感菌液中适当稀释混合液涂布于琼脂培养基上计数噬菌斑噬菌斑:概念：将少量噬菌体与大量敏感菌混合培养在营养琼脂中，在平板表面布满宿主细胞的菌苔上,可以用肉眼看到一个个透明的不长菌的小圆斑，称为噬菌斑。(每个噬菌斑一般是由一个噬菌体粒子形成的。)应用:噬菌斑可用于检出、分离、纯化噬菌体和进行噬菌体的计数。噬菌斑以培养时间为横坐标,以噬菌斑数为纵坐标,绘制成的曲线为一步生长曲线。可分以下阶段：潜伏期裂解期稳定期一步生长曲线潜伏期：从噬菌体吸附细菌到细菌细胞释放新的噬菌体之前的这段时期.曲线平行于横轴，噬菌体数无变化.样品中无游离的噬菌体。(潜伏期前的噬菌斑数是噬菌体数,也就是感染噬菌体的细菌数).裂解期：曲线直线上升,子代噬菌体不断释放到培养基中,直到达到一个极限.稳定期:感染细胞后复制的子代噬菌体全部释放，噬菌斑数稳定，一次感染结束。裂解量:每一受感染细胞所释放的新的噬菌体的平均数。稳定期噬菌斑数裂解量=潜伏期噬菌斑数不同的噬菌体或同种噬菌体感染敏感菌后所释放的噬菌体数不同,与噬菌体种类、宿主细胞菌龄以及环境因数有关。2、温和噬菌体与溶源性细菌温和噬菌体：噬菌体感染细胞后，将其核酸整合（附着）到宿主的核DNA上，并且可以随宿主DNA的复制而进行同步复制，在一般情况下，不引起寄主细胞裂解的噬菌体。原噬菌体（或前噬菌体）：即整合在宿主核DNA上的噬菌体的核酸。溶原性细菌：指在核染色体上整合有原噬菌体的细菌。可进行正常生长繁殖,而不被裂解。溶原性细菌的特点：可稳定遗传：子代细菌都含有原噬菌体，均具有溶原性。可自发裂解：温和噬菌体的核酸也可从宿主DNA上脱落下来，恢复原来的状态，进行大量的复制，变成烈性噬菌体，自发裂解几率10-2～10-5。可诱导裂解：用化学、物理方法诱导具有“免疫性”：溶原菌对其本身产生的噬菌体或外来的同源的噬菌体不敏感，对同源噬菌体具免疫性，对非同源噬菌体没有免疫性。