生物芯片技术的发展及其在农业科学上的应用

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1生物芯片技术的发展及其在农业科学上的应用摘要:生物芯片的应用是将探针固定于芯片上,利用核酸链间的分子杂交,鉴定DNA和蛋白质的一种新技术。尽管生物芯片仅仅出现几年,但它带来的信息却蕴藏着生物学中结构与功能的内在联系,其应用具有十分巨大的潜力,它已在功能基因组研究、新药研究、物种改良和医学诊断、军事科学等方面提供或正在提供极有价值的信息,已成为科学家们手中的有力武器。本文主要阐述了生物芯片技术种类和在农业科学应用方面的近期研究进展。关键词:芯片技术、研究应用、农业科学一、生物芯片技术简介生物芯片技术是一种高通量检测技术,通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值,如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序(Sequencingbyhybridization,SBH)等,为后基因组计划时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具,将会使新基因的发现、基因诊断、药物筛选、给药个性化等方面取得重大突破,为整个人类社会带来深刻广泛的变革。该技术被评为1998年度世界十大科技进展之一。(1)它包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室三大领域。基因芯片(Genechip)又称DNA芯片(DNAChip)。它是在基因探针的基础上研制出的,所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。它将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。蛋白质芯片与基因芯片的基本原理相同,但它利用的不是碱基配对而是抗体2与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。蛋白质芯片构建的简化模型为:选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体),这样形成蛋白质的微阵列,即蛋白质芯片。芯片实验室为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统,它最终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成,从而使现有的许多烦琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化和微缩化,属未来生物芯片的发展方向。二、生物芯片的主要类型1、基因芯片(genechip):又称DNA芯片(DNAchip)或DNA微阵列(DNAmicroarray),是将cDNA或寡核苷酸按微阵列方式固定在微型载体上制成。2、蛋白质芯片(proteinchip或proteinmicroarray):是将蛋白质或抗原等一些非核酸生命物质按微阵列方式固定在微型载体上获得。芯片上的探针构成为蛋白质或芯片作用对象为蛋白质者统称为蛋白质芯片。3、细胞芯片(cellchip):是将细胞按照特定的方式固定在载体上,用来检测细胞间相互影响或相互作用。4、组织芯片(tissuechip):是将组织切片等按照特定的方式固定在载体上,用来进行免疫组织化学等组织内成分差异研究。5、芯片实验室(Labonchip),用于生命物质的分离、检测的微型化芯片。现在,已经有不少的研究人员试图将整个生化检测分析过程缩微到芯片上,形成所谓的“芯片实验室”(Labonchip)。芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。它将样品的制备、生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统。由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探测器等组成的芯片实验室已经问世,并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的芯片)。“芯片实验室”可以完成诸如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作。这些微型集成化分析系统携带方便,可用于紧急场合、野外操作甚至放在航天器上。例如可以将样品的制备和PCR扩3增反应同时完成于一块小小的芯片之上。再如GeneLogic公司设计制造的生物芯片可以从待检样品中分离出DNA或RNA,并对其进行荧光标记,然后当样品流过固定于栅栏状微通道内的寡核苷酸探针时便可捕获与之互补的靶核酸序列。应用其自己开发的检测设备即可实现对杂交结果的检测与分析。这种芯片由于寡核苷酸探针具有较大的吸附表面积,所以可以灵敏地检测到稀有基因的变化。同时由于该芯片设计的微通道具有浓缩和富集作用,所以可以加速杂交反应,缩短测试时间,从而降低了测试成本。三、生物芯片技术的发展21世纪将是生命科学的世纪,基因芯片技术是近年产生的一项生物高新技术,它将像计算机一样成为21世纪即将来临的又一次新兴革命的奠基石[7,8]。基因芯片技术的产生与发展与人类基因组计划(的研究密不可分[9]。人类基因组的大量信息需要有一种快速、敏感、平行检测的技术,随着越来越多的基因被解码,基因的功能研究成为迫切需要解决的课题。在这一背景下,以基因芯片技术为主体的生物芯片诞生了,它被誉为是20世纪90年代中期以来影响最深远的重大科技进展之。1989年EdSouthern提出了利用在玻片表面固定的核苷酸探针进行基因序列测定的实验设计;而真正使基因芯片技术发展并实用化的,是得益于非孔固相支持介质的使用和高密度原位合成核苷酸两项技术的发明,从而推进了基因芯片产品的商业化。在美国硅谷,1992年从Affymax派生出来的世界上第一家专门生产生物芯片的公司Affymetrix宣告成立。Forder(现任Affymetrix总裁)及其同事在20世纪90年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法,在此基础上于1993年设计了一种寡核苷酸生物芯片。1994年在美国能源部防御研究计划署、俄国科学院和俄国人类基因组计划1000多万美元的资助下研制出了一种生物芯片,用于检测β-地中海贫血病人血样的基因突变。1998年美国的纳米基因公司(Nanogen)利用生物芯片在世界上构建了首例缩微芯片实验室,该成果被美国期刊选入。41998年被列入世界10大科技突破。最近几年,国际上掀起了基因芯片设计热潮,使基因芯片技术得到不断完善和发展,出现了多种芯片技术。最初的芯片主要目标是用于DNA序列的测定、基因表达图谱鉴定及基因突变体的监测和分析,因此称为基因芯片。但目前这一技术已扩展到非核酸领域,如已出现了蛋白质芯片分析技术、Biacore技术和丝网印刷技术等。在这一发展趋势下,芯片技术现多被称为生物芯片技术。根据芯片上固定的探针的不同,可将生物芯片分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片等;根据原理的不同,可以分为元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片;根据所进行的反应过程,可将生物芯片分为生物样品的制备芯片、PCR芯片、毛细管电泳芯片及PCR毛细管电泳芯片等。四、生物芯片的基本操作程序根据Watson和Crick提出的DNA双螺旋原理而发展的核酸链间分子杂交的技术是芯片检测关键的一步。在此步中发生核酸与探针之间的选择性反应。反应双方中总有一方固定在芯片上,而另一方则在标记后通过流路或加样至芯片上,芯片杂交中固定在芯片上的往往是成千上万的探针,而与之杂交的是经过标记(同位素或荧光)的样品核酸,此靶标样品核酸往往需先经过PCR扩增或克隆或逆转录,然后打碎成文库。同位素或荧光标记则在扩增或逆转录时引入,标记的靶标与固定探针必须在经过试验确定的严谨条件下进行分子杂交。芯片杂交属于固-液相杂交,与膜上杂交相似。影响异源杂交双链形成的因素包括靶标浓度、探针浓度、杂交双方的序列组成、盐浓度及温度。选择的条件要使成千上万对的杂交反应中的最大多数处于最佳状况中,也就是说要使尽可能多的正确配对物都能不遗漏,使有错配的杂交降低至最低。荧光标记是芯片信息采集中使用最多的也是最成功的一种标志。利用激光光源激发荧光靶标,使其发射出特定波长的荧光,再利用扫描仪对芯片进行扫描,采集各杂交点的荧光信号位置、荧光强弱,将所得图像输入软件进行计算机运算和分析。五、生物芯片技术在农业科学上的应用种技术对农林业具有极其巨大的重要性。生物芯片在农业科学中有广阔的应用天地,通过平行检测基因表达谱进行功能分析,有助于研究者更好地了解植5物生长和发育的根本机理。如果取得了植物各发育阶段的激素作用、除草剂作用、遗传背景和环境条件等一系列有关数据和信息,通过芯片分析将可了解植物学中涉及到的众多基因的作用。其中特别有经济价值的有:用芯片检测植物激素对植物基因表达的影响,环境因素(如干旱、肥力、虫害等)对植物基因表达的影响。最终有可能免去费时费钱的大田试验而获得需要的信息。应用芯片与基因再测序将大大加快DNA多态性的鉴定,这又将促进植物育种和新品种的产生,这种分子育育种技术对农业具有极其巨大的重要性。1、基因表达检测常规检测基因表达的方法需要大规模测序,一次仅能检测少量基因表达,而且灵敏度也不是很高,而生物芯片技术不仅可高敏感的定量、定性检查基因表达水平,而且能同时研究同一组织中成千上万个基因的表达。生物芯片技术以用于检测植物根、叶组织中基因表达水平的差异。实例:Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列(其中14个为完全系列,31个为EST),检测植物的根、也组织内这些基因的表达水平,用不同颜色的荧光标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交,经激光共聚焦显微扫描,发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异,而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织教跟组织表达高500倍。2、新基因的发现生物芯片技术与传统的差异显示技术相比有许多优点,例如被检目标DNA密度高、样品用量极少、自动化程度高,便于大量筛选新基因,使发现新基因的速度大大提高。利用生物芯片技术可高效、快速发展心的高产、优质、抗逆、抗病和抗虫等基因。实例:科研工作者测定了36000个棉花纤维伸长期EST,获得了12230个棉花纤维伸长期uniEST,并制备了含有11692个uniEST的基因芯片,获得相关EST603个和10个棉花纤维中特意表达的基因,发现了棉花纤维发育过程中显著上调若干条代谢途径,为通过调节植物激素的变化来控制棉花纤维发育奠定了基础。3、基因多态性的检测NDA芯片技术课大规模地检测和分析DNA的变异鸡多态性,有望了解农业作物天然种群的遗传学结构和探查种内的遗传多样性,这是研究农作物的起源、6进化和系统分类亦有很大帮助。4、研究作物杂种有时预测的方法由于生物芯片具有并行、高效等特点,可将发现的强优势标记基因制作成芯片,然后与未知优势品种的NDA进行分子间杂交,有望判断品种之间杂交组合优势的强弱。5、鉴别生产商的假冒伪劣种子将杂交种子的特异性标记基因制作成芯片,可用于检测弄作物种子的纯度。这种方法快速且特异性强,缺点是成本高。相信在不久的将来,随着芯片技术的不断升级换代,它必将被广泛应用于农业科学各个领域。生物芯片技术将为我们提供一条认识生命本质的捷径。芯片制作工艺流程图7应用生物芯片进行研究的总流程图芯片的准备样品的准备方法1直接购买芯片(即用型)方法2自行设计并向厂家定做芯片方法3购买芯片点样仪购买合成digo/大规模PCR扩增目的的片段点样及固定待测样品酸纯化探针制备和标记探针纯化杂交图像采集和分析反转录标记/PCR标记/随机引无标记8参考文献:【1】包家立,吴瑞英.生物芯片核酸序列测定的新技术[J].世界医疗器械.1997.【2】冯斌,谢先之.基因工程技术[M].北京:化学工业出版社,2000.【3】吴兴海,陈长法,张云霞,郑媛.基因芯片技术及其在植物检疫工作中应用前景植物检疫.2006.【4】《人民日报海外版》(2001年03月19日第六版)【5】百度百科,百度论文网【6】马立人,蒋中华.生物芯片[M].北京:化学工业出版社,2000.【7】包家立,吴瑞英.生物芯片核酸序列测定的新技术[J].世界医疗器械.1997.【8】李瑶.基因芯片技术———解码生命[M].北京:化学工业出版社,2004.【9】钟春英,彭蓉,彭建新,等.蛋白质芯片技术[J].生物技术通报,2004(2).【10】张高祥,陈一资,黄小波.基因芯片技术及其在食品安全检测中的应用.中国国境卫生检疫杂志2007.30(2).【11】陈启龙,唐鑫生.生物芯片技术及其应用前景.资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