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精子形态学分析的标准化生殖健康一、精子的基本形态•精子主要由三部分组成头部颈部和中段尾部1.精子的正常形态头部：扁椭圆形，长4~5μm、宽2.5~3.5μm、厚约1.0μm。中段：细，宽度＜1μm，大约为头部长度的1.5倍；胞浆小滴＜正常头部大小的1/2。尾部：长约45μm，比中段细，均一、非卷曲。精子头部超微结构1.核2.顶体3.细胞膜4.核囊5.核膜孔6.颈部7.基底板8.横纹小柱9.中心子（近端）10.中心子（远端）11.外纤维12.鞭毛轴丝13.线粒体精子超微结构•A精子的整体形态：1.头部顶体，2.颈部，3.中部，4.尾部•B中部与尾部的联结部位：5.中部断面线粒体，6.纤维鞘，7.九根外纤维，8.九根周围小管，9.组中心小管，10.细胞膜•CB的断面：11.纵向支柱•D尾部近远端•E终端主节与终节相连部•F终节：12.微细管精子颈部和中段超微结构•B颈部（局部）：1.线粒体，2.外纤维，3.细胞膜4.中心子（近位）5.中心子（远位），6.外纤维7.横纹小柱，8.关节样小头9.关节样小头顶，10.轴丝•C中部断面：1.线粒体2.外纤维2.异常精子形态•头部缺陷锥形、梨形、圆形无定形、头部有空泡小顶体头部缺陷的异常精子•顶体过小•顶体过大•头部一侧呈椭圆形的弧形•颈部和中段缺陷颈部弯曲中段非对称性插入中段过粗中段过细胞浆小滴2.异常精子形态•颈部过粗颈部和中段缺陷的异常精子•中段和头部分离•尾部连接处扁平•尾部缺陷短尾折尾尾部弯曲2.异常精子形态二、精子形态与功能1.头部主要的结构:细胞核和顶体细胞核:父方的遗传物质、单倍体，双链DNA，与鱼精蛋白紧密结合。顶体:覆盖精子核前2/3的扁囊状结构含有多种与卵子的识别和受精相关的酶其中最重要的是顶体蛋白酶和透明质酸酶2.颈部和中段连接头部和尾部中段的线粒体鞘含有大量的线粒体为精子的运动提供能量9+2结构二、精子形态与功能3.尾部运动二、精子形态与功能三、精子形态分析常用方法用于精子形态学分析的染色方法有：改良巴氏染色法、苏木精-伊红（HE）染色法、瑞氏染色法、瑞-吉氏染色法、Diff-Quik染色法和Shorr染色法。6种染色方法对精子头大小的影响不同，瑞-吉氏和瑞氏染色法的精子头的长轴和短轴最高，其次为Diff-Quik染色法，巴氏染色法的精子头的长轴和短轴最低，而HE和Shorr染色法的精子头长轴和短轴介于巴氏染色法和Diff-Quik染色法之间。6种精子染色方法的染色效果亦不同:Diff-Quik和Shorr染色法可以很清楚地区分顶体和核其次为HE染色法，而巴氏、瑞氏和瑞-吉氏染色的精子顶体和核分界不很明显。基于不同染色方法对精子头大小的影响、染色效果以及操作的简易与否，推荐Diff-Quik和Shorr染色法。三、精子形态分析常用方法•精子形态分析的标准有：WHO标准严格标准；•分析方法：人工法计算机自动分析三、精子形态分析常用方法1．涂片的制备一般用新鲜的液化精液或生理盐水洗涤过的精子悬液进行涂片，通常每份标本涂双份片子，以备染色或操作出问题。载玻片应洁净，可用70%酒精洗涤并干燥后使用；涂片的厚薄应根据精子密度而定，精子密度高者涂片应薄些，而精子密度低者涂片应尽可能厚些。方法涂片的方法有多种，WHO推荐的方法有拉薄技术和滴管法，拉薄技术即用另一张载玻片的边缘拖拉载玻片上的一滴精液；滴管法即水平持滴管使一滴精液沿载玻片的表面展开。由于精液有一定粘稠度，这两种方法都很难涂成均匀的涂片，可作为可选择性方法使用。三、精子形态分析常用方法推荐涂片方法推荐精子涂片方法(改良滴管法)：用滴管将一滴精液置于载玻片上，然后从液滴中央向周围循环吸净多余的精液，注意滴管的头要平整，滴管与载玻片垂直，缓慢吸去多余的液体。低密度、粘稠的、或充满碎屑的标本，建议先离心去除精浆，沉淀的精子团重新悬浮在适当体积中，以获得尽可能高的密度，但不应超过80×106/ml。正常精子密度且液化良好的精液标本亦可以洗涤后用精子悬液进行涂片，但离心操作对精子形态分析有无影响，尚需要进一步验证。精子涂片可进行空气干燥并固定。固定程序取决于染色方法。三、精子形态分析常用方法2．Shorr染色法（WHO推荐）精子涂片空气干燥后，用苏木精染色1~2分钟；流水浸洗后置42℃温水中蓝化5分钟（或浸入乙醇铵中蓝化）；Shorr染剂（BDHShorr粉4g溶于220ml50%温乙醇中，冷却，加入2.0ml冰醋酸，过滤即可）染3~5分钟；流水冲洗，晾干后镜检。3．Diff-Quik染色法（WHO、SCA分析系统推荐）精子涂片先置于固定液（1.8mg二芳基甲烷加至1L甲醇中而成）中固定15秒；将玻片直立于吸水纸上以去除多余的液体；将玻片在溶液1（1g氧甲蒽加至1L叠氮钠防腐液中）中染色10秒钟，然后在溶液2（0.625g天蓝A和0.625g亚甲基蓝加至1L缓冲液中）中染色5秒钟，各步骤之间均除去多余的液体；在流水中浸洗10~15次以除去多余的染料；将玻片垂直竖立以去除水分，使之完全干燥；油镜下观察。三、精子形态分析常用方法4．改良巴氏染色(WHO推荐)(1)EA-50的配制将伊红Y、俾士麦棕、亮绿SF染剂分别配成100g/L的水溶液，作储备液；将上列储备液伊红Y5ml，俾士麦棕1ml，亮绿1.25ml混匀，用95%乙醇加至200ml。然后加入0.4g磷钨酸和0.1ml饱和碳酸锂溶液，混匀后放入棕黑色瓶中，于室温可保存3个月左右。使用前必须过滤。(2)橙黄G6的配制称橙黄G60.5g，溶于5ml蒸馏水，待溶解后加95%乙醇至100ml，然后加磷钨酸15mg，混匀后置棕黑色瓶中，用前必须过滤。室温下此液可保存3个月。三、精子形态分析常用方法4．改良巴氏染色(WHO推荐)(3)哈里斯(Harris)苏木精的配制称硫酸铝铵20g，溶于200ml蒸馏水；称苏木精1g，溶于10ml95%乙醇中。将苏木精溶液加入硫酸铝铵溶液中，混匀并加热至95℃。然后慢慢加入氧化汞0.8g。搅拌使其溶解，此时溶液呈深紫色。冷却后过滤，使用前以等量蒸馏水稀释，并再一次过滤。(4)酸性乙醇溶液的配制无水乙醇30ml，加浓盐酸0.2m和蒸馏水10ml混匀。(5)固定液的配制无水乙醇：乙醚为1:1。三、精子形态分析常用方法4．改良巴氏染色(WHO推荐)(6)操作方法①将洗涤后的精子悬液涂片，在空气中自然干燥，然后用固定液固定6~10分钟㈩②将已固定的涂片依次浸入80%，70%，50%乙醇内30秒，最后置于蒸馏水中1分钟；③在苏木素染液中染10分钟，取出流水洗5分钟，然后浸入酸性乙醇1分钟，流水洗5~10分钟；④涂片依次浸入50%，70%，80%，95%乙醇内各30秒㈩⑤在橙黄G6染液中染3~5分钟，在95%乙醇中浸洗1分钟；⑥在EA-50染液中染15~20分钟，于95%乙醇中浸洗30秒，再依次浸入3缸二甲苯中使其透明，每缸约1~2分钟㈩⑦用光学树脂加盖片封固，油镜下观察。三、精子形态分析常用方法5．苏木紫－伊红染色法(HE)(1)苏木紫染液的配制实验室常用的是哈里斯(Harris)苏木紫液。甲液：苏木紫1g，无水乙醇10ml；乙液：硫酸铝钾20g，蒸馏水20ml，加温溶解。甲、乙两液分别溶解后混合，加热煮沸，沸后去火，待溶液不翻腾时立即加入氧化汞0.5g(此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出)。然后使染液迅速冷却，冷却后过滤即可应用。用时每10ml加冰醋酸4ml。(2)伊红Y液配制伊红Y1g，蒸馏水5ml，溶解后将冰醋酸滴于其中，有沉淀生成，至成浆糊状再加水数毫升，并继续滴冰醋酸，直至沉淀不再增加，过滤，弃滤液留沉淀物，特其干燥后，溶于95%乙醇200ml中即成。三、精子形态分析常用方法5．苏木紫－伊红染色法(HE)(3)固定液配制9５％乙醇：乙醚为1:1。(4)操作方法①涂片置固定液中固定15分钟；②已固定的涂片流水洗2分钟，蒸馏水洗1分钟；③苏木紫液染色约5分钟(视着色情况增减)；④水洗，1%盐酸分色，显微镜下控制；⑤流水浸洗至少15分钟，至细胞核呈蓝色；也可短时水洗后，浸于40℃温水使核变蓝。在显微镜下观察，若核染色过深或不足，应再次分色或重染；⑥伊红Y液染1~2分钟后，95%乙醇浸洗2次，无水乙醇浸洗2次，每次约1~2分钟；⑦苯酚:二甲苯(1:3)浸洗5分钟；⑧二甲苯2次，每次浸洗3~5分钟；⑨用中性树胶封片，显微镜下观察。三、精子形态分析常用方法6．瑞-姬氏混合染色法(1)瑞氏染液称取瑞氏染料0.1g，放在清洁干燥乳钵里，加少量甲醇，边加边磨使染料溶解。将已溶解的染料倒入棕色瓶中，加甲醇至60ml，置室温下1周即可使用。(2)姬姆萨染液称取姬母萨染料0.5g，置于33ml甘油中，60℃水浴2h，使其溶解，再加入60℃预热的甲醇33ml，混合后置棕色瓶内，室温下放置数日后方能使用。(3)操作方法:取液化的精液离心(１000r/min)10分钟，弃上清液，留取沉淀再加生理盐水，相同上述操作，洗涤3次，配制成10×106/ml浓度的精子悬液，涂片自然干燥。用瑞-姬氏混合液(10:1)染30~60秒，加等量pH6.9磷酸盐缓冲液，染色10分钟，自来水冲洗，待自然干燥后，用光学树脂封片，置油镜下镜检。三、精子形态分析常用方法四、精子形态分析与临床精子形态是迄今为止和受精率最相关的指标，并且操作简单，费用少。不少研究机构的研究结果表明，采用严格精子形态分析能较好地预测受精结果。一般将正常形态精子的正常值定为15%，正常形态精子＞15%的精子，体外受精率在80%以上；而正常精子低于5%的，其IVF受精率＜30%。精索静脉曲张患者头部缺陷、含胞浆小滴精子的比例比正常者显著升高，并随精索静脉曲张程度的增加而升高。少、弱精子症患者精子形态异常的比例显著增加，异常精子中以头部缺陷为主。四、精子形态分析与临床解脲支原体等感染的精液，异常精子率显著增加。四、精子形态分析与临床长期接触农药或服用绵籽油，可引起以小头精子、颈部缺陷精子为主的异常形态精子的比例升高。四、精子形态分析与临床吸烟和大量饮酒是产生异常形态精子增加的重要因素，异常精子以头部异常为主。四、精子形态分析与临床雷达辐射可造成双头精子、大头精子、无定形精子、颈部和中段异常精子显著升高。四、精子形态分析与临床在去除感染、辐射、农药中毒、不良生活习惯（吸烟等）的因素后，正常形态精子的比例迅速增加。精子形态分析是提供男性不育症预后的重要指标。四、精子形态分析与临床一些中药、微量元素（锌等）、抗氧化剂等能有效提高正常精子的比例。四、精子形态分析与临床现有资料表明：精子形态是与男性生殖能力最相关的精液参数之一。精子形态分析方法简单、实用性强，临床医生应高度重视。精子形态分析的标准化亟待完善和推广。四、精子形态分析与临床•九十年代实验室检查精液大多采用人工方法,但较八十年代比较,由于不少单位使用了MACRO精子计数板而提高了准确性。•近十年来电脑技术的运用使精子速疫和轨迹成为精液分析的重要参数。•精子形态检查成为重要的男性不育症的分析指标,仪器设备的更新势在必行,谁先更新谁的诊疗技术先提高,科研成果更有价值。抢占市场先机更能吸引更多的病人,创造更好的经济效益。ThankYou!