生物芯片技术研究进展

生物芯片技术研究进展张智梁摘要：随着DNA测序技术的发展和几种同时监测大量基因表达的新技术出现，人类基因组DNA序列分析可能很快完成，并由此产生了生物信息学，而DNA芯片技术应运而生。生物芯片主要是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析，是近些年来发展迅速的一项高新技术。生物芯片主要包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。关键词：生物芯片；研究进展；应用生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析，其实质就是在面积不大的基片(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)表面上有序地点阵排列一系列已知的识别分子，在一定条件下，使之与被测物质(样品)结合或反应，再以一定的方法(同位素法、化学荧光法、化学发光法、酶标法等)进行显示和分析，最后得出被测物质的化学分子结构等信息。因常用玻片／硅片等材料作为固相支持物，且制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。这项技术是由美国旧金山以南的的一个新兴生物公司首先发展起来的。S.P.AForder及其同事于90年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法，并在此基础上于l993年设计了一种寡核苷酸生物芯片，直至l996年制造出世界上第一块商业化的DNA芯片。在此期间国际上掀起了一片DNA芯片设计的热潮，出现了多种类型的DNA芯片技术。DNA芯片在产生的短短几年时间内技术不断，现已经显现出在基因诊断、基因表达分析和新基因的发现、蛋白组学方面的应用、基因组文库作图等生物医学领域中的应用价值。l、生物芯片的分类目前常见的生物芯片分为3类：第1类为微阵列芯片，包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片；第2类为微流控芯片(属于主动式芯片)，包括各类样品制备芯片、聚合酶链反应(PCR)芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等；第3类为以生物芯片为基础的集成化分析系统(也叫“芯片实验室”，是生物芯片技术的最高境界)。“芯片实验室”可以完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作。这些微型集成化分析系统携带方便，可用于紧急场合、野外操作甚至放在航天器上。2、生物芯片的应用2．1基因测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速，具有十分诱人的前景。芯片技术能辨别单核苷酸多态性(SNPs)，当基因组序列中的单个核苷酸发生突变，就会引起基因组DNA序列变异。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCAl基因序列差异，结果发现在外显子11约3．4kb长度范围内的核酸序列同源性为83．5％～98．2％，提示了二者在进化上的高度相似性。Check等通过运用DNA微集阵列分析研究与早期心血管疾病相关的候选基冈一丁SP基冈家族，结果发现TSP-1和TSP-4基因错义变异与早期冠状动脉疾病相关，它们在m液凝固和动脉修复中起重要作用，而丁SP一2基冈非编码区的突变却在心脏病的发生过程有一定的保护作用。在卵巢癌发展过程中，基因TP53起到临界基因作用，Haviv等分别使用传统的DNA序列分析法和一种TP53寡核苷酸微阵芯片对108例卵巢肿瘤进行分析，根据TP53突变共计识别77例卵巢癌，使用微阵列分析识别71例，而传统的凝胶电泳DNA序列分析识别63例，从整体来看，相对于传统的DNA序列分析而言，寡核苷酸微集阵列显示出更高的精确度和灵敏度。2．2寻找新基因利用大规模集成电路的手段控制固相合成的成千上万个基因片段探针，并把它们有规律地排列在指头大小的硅片上，然后将要研究的材料(如DNA或eDNA)用荧光标记后在芯片上与探针杂交，再通过激光显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对每一个探针上的荧光信号做出比较和检测，从而迅速得出所需的信息。通过对大量信息进行处理，确定细胞的基因表达谱，这与传统的差异显示技术相比具有许多优点，被检测目标DNA密度高，样本用量极少，自动化程度高，便于大量筛出新基因，使发现新基因的速度大大提高，尤其在后基阈时代，基冈芯片技术将大显身手。White等为了鉴定果蝇发育过程中的基因表达，制作了高密度的DNA芯片，鉴定结果包括了几十个melanogaster基因，除了已知的在变态过程中激活的差异表达基因，还发现了许多与变态控制和执行有关的功能基因。Schena等从人外周血淋巴细胞cDNA文库中获得1046个未知序列的克隆，将其制成DNA芯片，分别与热休克、佛波酯(PMA)处理和未处理的T细胞进行杂交，获得17个热休克相关差异表达的基因，无一个是热休克诱导表达的，6个表达下调，在PMA处理的T细胞6个差异表达的基冈中有一个为新基因。2．3基因芯片在疾病的临床诊断方面的优势，与传统检测方法相比，它可以在一张芯片上同时对多个病人进行多种疾病的检测，无需机体免疫应答反应期，能及早诊断，待测样品用量小；能特异性检测病原微生物的亚型及变异；可帮助医生及患者从“系统、血管、组织和细胞层次(通常称之为‘第二阶段医学’)”转变到“DNA、RNA、蛋白质及其相互作用层次(第三阶段医学)”上了解疾病的发牛、发展过程，这些特点使得医务人员在短时间内，可以掌握大量的疾病诊断信息，这些信息有助于医生在短时间内找到正确的治疗措施。Bubendorf等利用cDNA芯片来鉴定耐激素的人类前列腺癌细胞的差异表达基因，cDNA芯片上有耐激素和激素敏感的人类前列腺癌细胞的5184个基因。为了证实结果，用良性前列腺增生、初期前列腺癌、耐激素的前列腺癌3种样本制作了组织切片，并用免疫组织化学方法检测蛋白表达。eDNA芯片与组织切片的结合能够快速鉴定出前列腺癌处于耐激素阶段的基因。Hacia等利用含有96000个寡核苷酸的I)NA芯片检测了人BRCAl基因第11外显子全长3．45kb的突变。在检测的15例病人样品和20例对照样品时，发现14例病人样品有基因突变，而埘照样品则为假阳性结果。Onok等运用cDNA微阵列技术检测5例浆液性卵巢癌，4例黏液性卵巢癌病人，与自身无癌变的卵巢组织进行对照，发现用CY3标记的卵巢癌cDNA探针和用CY5标记的正常卵巢的cDNA探针与基因芯片上已知的9121个与癌相关基因的cDNA探针杂交反应，发现55个基因在6个肿瘤病人中出现上调，48个基因在8个病例中出现下调。Wen等用传统的DNA序列分析法和cDNA微阵列分析了108例卵巢肿瘤患者中TP53的变化，发现用cDNA微阵列检测的正确率达94％。2．4药物筛选生物芯片对于药物靶标的发现、多靶位同步高通量药物筛选、药物作用的分子机理、药物活性及毒性评价方面都有其它方法无可比拟的优越性，可大大节省新药开发经费；并且可对由于不良反应而放弃的药物进行重新评价，选取可适用的患者群，实现个性化治疗。基因芯片发现基因组中可能的药物作用靶点和验证分枝杆菌巾的研究很好地体现了这两个用途。结核病是全世界重新关注的焦点，日益严重的耐药性使得开发新的抗结核病药物成为全球各大制药公司投资的重点之一。异烟肼(INH)在结核病人临床上使用最广泛，细菌对它的耐药性也最频繁。因此，基冈芯片在微生物功能基因组中的运用首先是研究INH诱导的结核分枝杆菌基因表达差异，期望发现新的抗结核病药物作用靶点。研究发现INH诱导几种基因的表达发生改变，进而选择性抑制分枝菌酸的生物合成。在被诱导的基因中有些被证明是INH的作用靶点，这些基因所在途径中被诱导改变的其他基冈也可能作为药物开发的新靶点。Kapp等用包含950个基因探针的基因芯片比较何杰金氏病细胞系L428及KMH2与EB病的B淋巴细胞系LGL-GK的基因表达谱，发现何杰金氏病原的细胞系中自细胞介素一13(IL-13)及白细胞介素一5(IL一5)表达异常增高，用lL一13抗体处理何杰金氏病原细胞系可显著抑制其增殖，此发现提示，IL-13可能以自分泌形式促进何杰金氏相关细胞增殖，IL-13及其信号传导途径可能成为何杰金氏病治疗及药物筛选的新靶点。研究各种药物对不同基凶的作用，从而在剂量和成分搭配上做到精确无误。相信在不久的将来，药品说明书上的适用症和禁忌症都会改为适用基因型和禁忌基冈型，使得药晶更加针对不同个体的不同疾病，达到疗效更佳、副作用更小的目的。3结语生物芯片的成熟和应用一方面将为诊断和治疗、新药开发、分子生物学、航空航天、食品卫生和环境监测等领域带来一场革命；另一方面生物芯片的出现为人类提供了能够对个体牛物信息进行采集和分析的强有力的技术手段，故必将成为信息学研究中一个重要的信息采集和处理平台。生物芯片充分利用了生物科学、信息学等成果，在医学、生命科学、环境科学等凡与其有关的领域均有重大应用前景；生物芯片技术发展到今天不过短短十几年时间，随着研究的不断深入和技术的更加完善，生物芯片将对21世纪人类生活和健康、社会经济和发展产生极其深远的影响。参考文献1.孙开来，昊东宁．DNA芯片的发展和意义[J]．国外医学：遗持学分册，1998(6)：28I～283．2.杨庆恩．单核多态性与DNA芯片技术在法医学中的应用[J]．刑事技术，2001，5：39～41．3.周建军.生物芯片［J］.国外医学分子生物学分册，2000，1（22）：5-9.4.冯永强.基因芯片技术［J］.国外医学分子生物学分册，2000，1（22）：1-4.5.BubendorfL，KolmerM，KononenJ，eta1．Hormonetherapyfail—ureinhumanprostatecancer；analysisbycomplementaryDNAandtissuemicroarrays[J]．JNatl‘CancerInst，1999，91：1758～1764．6.CheckDJ，CesanA．Geneticpredictorsofcardiovasculardisease：Theuseofchiptechnology[J]．JCardiovascNurs，2003，18(1)：50～56．7.HaciaJG，BrodyLC，CheeMS，eta1．DetectionofheterozygousmutationinBRCAlusingdensityoligonucleotidearraysandtwo-col—orfluorescenceanalysis[J]．NatureGenetics，199614(4)：441～447．8.HaciaJG，MakalowskiW，EdgemonK，etat．Evolutionaryse—quencecomparisonsusinghigh—densityoligonucleotidearrays．NatureGenetics，1998，18(3)：155～158．9.HavivI，CampbellIG．DNAmicroarraysforassessingovariancancergeneexpression[J]．MolCellEndocrinol，2002，191(1)：121～126．10.JosephG，WojciechM，KeithE，eta1．Evolutionarysequencecomparisonsusinghigh—densityoligonucleotidearrays[J]．Genet—ics，1998，18：155．11.KingHC。SinhaAA．GeneexpressionprofileanalysisbyDNAmicroarray：Promiseandfitfalls[J]．JAMA，2001，286(18)：2280～2288．12.KappU，YehWC，PattersonB，etal，Interleukin13issecreted—byandatimulatesthegrowthofHodgkinandReed-Sternbergcel