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如何分分钟看懂质粒图谱2016-05-11首先，第一步，看箭头。第二步，看上面的标签。第三步，看多克隆位点。MCS（MultipleCloningSite，也就是多克隆位点），一般图中会把多克隆位点上的酶切位点都标记出来。上面的酶切位点顺序，一般都是按照5`-3`的顺序排列下来的，需要注意的是这样几点。第一点是要注意：酶切位点边标注了*的一般是指并不仅仅存在一个位点，也就不能用来作为构建质粒的酶切位点。第二点需要注意：有的酶切位点，在序列中只有一个，但它上面也会标注一个*或者（dam），这说明可能这个酶切位点会有CpG岛的甲基化修饰[常见的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC无法切开]，一般也是不能用的。但是非要用这个酶切位点的话，就需要用非甲基化的感受态细胞，如JM109或者JM110。第四步，看多克隆位点的序列。多克隆位点一般会有上图这样的序列，也就是三联体密码加上酶切位点标示的序列。这里的三联体密码，主要是为了提示你，插入的表达的片段，需要按照这样的三联体进行插入，不要有移码突变。5`末端如果有差异的话，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替换1-2个碱基（变成GTG或者GCG这样），从第二个氨基酸序列开始完全一致即可。而配合扩增和酶切的话，插入片段是允许有3`末端的冗余。为了可以应付3`末端的冗余碱基，在多克隆位点序列后，会有译码的终止TAA密码，即使插入的片段使得3`末端产生了移码突变，照样能使表达的蛋白正常终止掉（在酵母双杂的AD质粒中，由于插入的是随机cDNA，所以AD的载体上会常见这样的结构）。注：1.起始密码子有两种，一种是甲硫氨酸（AUG），一种是缬氨酸（GUG），而终止密码子（有3个，分别是UAA、UAG、UGA）没有相应的转运核糖核酸（tRNA）存在，只供释放因子识别来实现翻译的终止。2.密码子阅读与翻译具有一定的方向性：从5'端到3'端。问题：1.如何了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）？看Ori的位置，原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体。2.如何区别克隆载体与表达载体？是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。3.为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针？那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上.4.外源DNA插入片段大小？质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说，外源DNA片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。